Functional importance of novel nucleotide variations in the CYP21A2 gene

A Hiperplasia Adrenal Congênita (HAC), uma das desordens autossômicas recessivas mais frequentes, é causada pela deficiência de enzimas esteroidogênicas envolvidas na biossíntese do cortisol. Uma consequência disto é o desvio da síntese para a produção de hormônios androgênicos. Na forma clássica da HAC, a exposição pré-natal intrauterina ao excesso de andrógenos durante estágios críticos da diferenciação sexual leva à virilização da genitália externa de fetos 46,XX resultando em uma genitália ambígua ao nascimento, à pseudopuberdade precoce em ambos os sexos e à crises de perda de sal quando a atividade residual enzimática é menor que 1%. Sinais de excesso de andrógeno na forma não clássica podem ser acne, hirsutismo e desordens menstruais em mulheres jovens, contudo podem se manifestar anteriormente no desenvolvimento como: puberdade precoce, crescimento linear acelerado e maturação óssea avançada. Todavia, é bem conhecido que alguns indivíduos com HAC não clássica podem permanecer assintomáticos. Os objetivos deste projeto foram analisar o papel funcional de dez novas mutações (p.Leu12Met; p.Arg16Cys; p.Ser101Asn; p.Ser202Gly; p.Pro267Leu; p.Val358Ile; p.Arg369Gln; p.Asp377Tyr; p.Thr450Met; e p.Leu461Pro), uma nova deleção in frame (p.Gln398_Ala391del), duas mutações que foram descritas anteriormente, entretanto sem estudos funcionais (p.Ser113Phe e p.Thr450Pro) e três combinações de mutações in cis (p.Ile172Asn+p.Val358Ile; p.Val281Leu+p.Arg369Gln; e p.Asp377Tyr+p.Leu461Pro); e estabelecer uma correlação genótipo-fenótipo para as mutações investigadas in vitro. Além dos métodos clássicos para os estudos moleculares, a metodologia deste estudo incluiu a expressão das proteínas CYP21A2 normal e mutantes para os ensaios de determinação da atividade enzimática e da cinética enzimática, bem como a verificação da expressão proteica por Western blot. Estudos in vitro demostraram que uma mutação é uma variante normal do gene CYP21A2 (p.Leu12Met) apresentando atividade residual próxima de 100%, nove (p.Arg16Cys; p.Ser101Asn; p.Ser202Gly; p.Pro267Leu; p.Val358Ile; p.Arg369Gln; p.Asp377Tyr; p.Thr450Met; e p.Leu461Pro) se associam à forma não clássica leve de HAC com atividades residuais entre 35% e 95% e, três (p.Ser113Phe, p.Gln398_Ala391del e p.Thr450Pro) resultam em HAC forma clássica com atividades residuais abaixo de 4%. As três combinações de mutações in cis apresentaram efeito sinergístico na atividade residual enzimática. Este estudo permitiu uma correta correlação genótipo-fenótipo (AU)