Efeito do secretoma presente no meio condicionado por células-tronco mesenquimais que superexpressam BMP-9 na diferenciação osteoblástica e no reparo ósseo de defeitos de calvária de camundongos

A terapia cell-free utilizando o secretoma celular presente no meio condicionado (CM) por células-tronco mesenquimais (MSCs) vem sendo relatadas na literatura científica como uma estratégia terapêutica promissora no campo da medicina regenerativa com vistas ao reparo do tecido ósseo. Este secretoma consiste num conjunto de fatores e moléculas secretadas para o espaço extracelular, o qual permite a comunicação celular, a regulação biológica e a modulação das diversas condições fisiológicas teciduais. Dentre as moléculas secretadas, está a proteína óssea morfogenética 9 (BMP-9), importante componente de tecidos ósseos endocondrais e intramembranosos, relatadas como uma das mais osteoprogenitoras da família das BMPs. Partindo disso, este estudo teve como objetivo investigar o potencial do secretoma presente no CM por células MSCs editadas geneticamente para superexpressão da proteína BMP-9 (CM-MSCsBMP-9) na indução da diferenciação osteoblástica in vitro de MSCs primárias e no reparo ósseo in vivo em defeitos críticos criados na calvária de camundongos. MSCs foram obtidas da medula óssea (MO) de camundongos machos da linhagem C57BL/6 de 8 semanas da idade e passaram pelo processo de edição gênica por meio da técnica de CRISPR-Cas9, sendo que um grupo foi infectado apenas com o vetor vazio (MSCsVPR) enquanto o outro grupo recebeu a combinação da endonuclease SP-dCas9-VPR mais o RNA guia customizado para a superexpressão de BMP-9 com repórter GFP positivo (MSCsBMP-9). Após a confirmação da efetividade desse processo por meio na análise da expressão gênica de Bmp-9 pela técnica de PCR em tempo real e a marcação positiva de GFP por citometria de fluxo, essas células foram utilizadas para o obtenção dos CMs em diferentes tempos. Confirmou-se por meio de teste imunoenzimático de ELISA a presença secretada de BMP-9 nos CMs coletados, sendo que seu maior pico de expressão se deu após 1 hora de cultura sem a presença do soro fetal bovino (SFB), período de eleição do CM a ser utilizado nos experimentos seguintes. Para avaliação do efeito dos CMs sobre a diferenciação osteoblástica de MSCs, as células foram crescidas em contato com o meio condicionado por MSCsVPR (CM-MSCsVPR) e por MSCsBMP-9 (CM-MSCsBMP-9) na proporção 1:1 com o meio de crescimento não indutor fresco (MEM 20%) sempre nas últimas 48 horas que antecediam o experimento a ser realizado. Avaliou-se a capacidade de migração celular pelo método scratch, a viabilidade celular por meio de ensaio colorimétrico de MTT, a expressão gênica de marcadores ósseos (Runx2, Alp e Opn) por PCR em tempo real, a expressão proteica de marcadores ósseos (RUNX2, ALP e OPN) por western blot e a atividade fenotípica de ALP in situ pelo método Fast Red. Foi perceptível o efeito positivo de CM-MSCsBMP-9 sobre a diferenciação osteoblástica de MSCs, o qual foi capaz de induzir um perfil osteoblástico fenotípico in vitro. Já para a avaliação do efeito dos CMs sobre o reparo ósseo, uma semana após a criação de defeitos críticos de 4 mm criados em calotas cranianas de camundongos, fez-se o tratamento dos defeitos pela injeção de um volume de 25 µL de CM-MSCsVPR e CM-MSCsBMP-9. Quatro semanas após o tratamento, percebeu-se por meio das reconstruções tridimensionais da análise morfométrica de µCT, que o tratamento com CM-MSCsBMP-9 favoreceu a regeneração do tecido ósseo comparado aos defeitos tratados com CM-MSCsVPR e os animais que não foram submetidos a nenhum tratamento, gerando um maior volume ósseo, porcentagem de volume ósseo, superfície óssea e um maior número de trabéculas no tecido ósseo in vivo. Esses dados foram corroborados pela análise histológica, mostrando que as MSCs editadas geneticamente para superexpressão de BMP-9 foram capaz de formar um tecido ósseo com qualidade semelhante ao osso nativo, sem indicadores inflamatórios. Além disso, também observamos que o tratamento com CM-MSCsBMP-9 favoreceu a regeneração do tecido ósseo frente a defeitos tratados com MSCsBMP-9. Por fim, este estudo mostrou que o CM-MSCsBMP-9 possui alto potencial osteogênico e osteoindutor, sendo uma metodologia interessante para a aplicação clínica no campo da Odontologia e Medicina, na qual, além de suas vantagens a nível molecular para o reparo do tecido ósseo de sítios desafiadores, possui baixo custo da produção e a possibilidade da realização de uma terapia guiada para efeitos terapêuticos específicos. (AU)