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Mutações sítio-dirigidas nas regiões do sítio-ativo e da interface oligomérica do fator inibitório da migração dos macrófagos de Leishmania major (LmMIF2)

Texto completo
Autor(es):
Elise Marques Freire Cunha
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
Imprenta: Ribeirão Preto.
Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
Data de defesa:
Membros da banca:
Arthur Henrique Cavalcante de Oliveira; Mario Tyago Murakami; Richard John Ward
Orientador: Arthur Henrique Cavalcante de Oliveira
Resumo

O fator inibitório da migração de macrófagos (MIF) é considerado um importante fator no controle de infecções causadas por patógenos. Essa proteína foi encontrada primeiramente em mamíferos, mas verificou-se a presença de ortólogas em patógenos, sendo sugerida uma função moduladora do sistema imunológico do hospedeiro. A caracterização estrutural e funcional da proteína MIF em Leishmania major pode contribuir para o entendimento das funções dessa proteína na relação parasita/hopedeiro. Este trabalho teve como objetivo realizar mutações sítio-dirigidas da sequência codificadora do fator inibitório da migração de macrófagos de Leishmania major (LmMIF2) e investigar o efeito dessas mutações na manutenção da estrutura e na função dessa proteína. A mutagênese sítio-dirigida foi realizada em 3 etapas de reações de PCR, os fragmentos obtidos foram purificados, seqüenciados e clonados em vetor pET21b usando as enzimas de restrição NdeI e HindIII. A LmMIF2 recombinante (rLmMIF2) e os mutantes P2G, K34E, W66L, W108F e Δ104-113, todos eles contendo uma cauda de histidina, foram eficientemente expressos na forma solúvel em E. coli e foram purificados do lisado celular por cromatografia de afinidade. O gel de SDSPAGE mostrou uma banda única em 14.5kDa e análises de filtração em gel mostraram que, em solução, o rLmMIF2 e os mutantes apresentaram-se como dímeros. Experimentos de dicroísmo circular (CD) e de emissão de fluorescência intrínseca de triptofanos (IFTE) foram realizados para acompanhar as mudanças na estrutura secundária e terciária dessas proteínas na variação de pH do ambiente. Análises de CD UV-distante e UV-próximo mostraram que a mutação de apenas um aminoácido pode influenciar na estrutura secundária e terciária da rLmMIF2 e que as mutações não alteraram a formação de estado de glóbulo fundido em baixos pHs. Os experimentos de IFTE mostraram que há um efeito de supressão intrínseca de fluorescência que foi abolido com a substituição do triptofano da posição 108. O mutante W66L mostrou uma intensidade de fluorescência 60% menor enquanto o mutante W108F apresentou uma intensidade 25% maior do que a rLmMIF2. Ensaios de inibição da migração de macrófagos mostraram que o mutante P2G apresentou atividade de inibição da migração similar à rLmMIF2, enquanto os outros mutantes apresentaram uma atividade diminuída em cerca de 50%. Estes resultados contribuem para elucidar o papel de regiões da LmMIF2 envolvidas na manutenção da estrutura e em mudanças conformacionais da proteína, que podem estar envolvidas na atividade de modulação da resposta imune do hospedeiro. (AU)

Processo FAPESP: 09/04272-0 - Mutações Sítio-dirigidas nas Regiões do Sítio-Ativo e da Interface Oligomérica do Fator Inibitório da Migração dos Macrófagos de Leishmania major (LmjMIF2)
Beneficiário:Elise Marques Freire Cunha
Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Mestrado