Avaliação do comportamento do PPAR beta/delta em processos de regeneração de pele e sua modulação por ligantes

Os Receptores Ativadores da Proliferacao de Peroxissomos (PPAR) sao fatores de transcricao modulados por ligantes e pertencentes a superfamilia dos receptores nucleares. O isotipo PPAR¿À/¿Â esta envolvido em processos metabolicos como metabolismo energetico, adipogenese e metabolismo de lipidios, sendo um alvo interessante para o desenvolvimento de farmacos para doencas metabolicas. Alem disso, esse receptor e o isotipo mais expresso em pele e esta envolvido em diversos processos nesse orgao, como manutencao da barreira epidermal, sintese de lipidios, diferenciacao epidermal e cicatrizacao, o que o torna um alvo para o desenvolvimento de farmacos ou dermocosmeticos que possam atuar em processos de regeneracao de pele. O objetivo geral deste trabalho foi prospectar compostos que possam atuar como ligantes ativadores do PPAR¿À/¿Â e investigar os efeitos da modulacao deste receptor por ligantes em celulas epiteliais. Foi desenvolvido um protocolo de triagem de agonistas para este receptor, composto por um ensaio de transativacao celular seguido por dois ensaios de caracterizacao biofisica da interacao ligante:proteina - ensaio de termoestabilidade e ensaio de supressao da fluorescencia da sonda 8-anilino-1-naftalenosulfonico. O protocolo desenvolvido apresenta melhorias em relacao aos ensaios de transativacao celular comumente utilizados para triagem de ligantes de PPARs: (i) semi-automatizacao; (ii) analise da citotoxicidade aparente; (iii) uso de metodologias biofisicas para confirmacao da interacao direta entre ligante:proteina; (iv) e afericao da afinidade entre os hits e o receptor por meio do calculo da constante de dissociacao. Apos padronizacao, este racional foi utilizado para triar 121 compostos isolados enviados por colaboradores, 560 extratos de plantas brasileiras da biblioteca Phytobios, 719 compostos da biblioteca drug-like NIH-NCC e 80 derivados semi-sinteticos de produtos naturais da biblioteca TimTec NDL-3,000 pre-selecionados por virtual screening. Ao final do pipeline de busca de agonistas, o Extrato 2 da biblioteca Phytobios e sua fracao Extrato 2-18 foram selecionados como hits de PPAR¿À/¿Â, pois apresentaram componentes que ativam e estabilizam a estrutura terciaria do receptor, com constantes de dissociacao de 0,011 } 0,007 mg/mL e 0,016 } 0,007 mg/mL, respectivamente. Alem do protocolo de triagem, foram padronizados metodos de migracao, proliferacao e diferenciacao de queratinocitos humanos (HaCaT) para caracterizacao da modulacao do PPAR¿À/¿Â por ligantes em processos de regeneracao de pele. Nestes ensaios, os agonistas comerciais GW0742, GW501516 e L-165,041 aumentaram a taxa de migracao 2D de queratinocitos humanos (HaCaT), e os agonistas GW501516 e L-165,041 diminuiram a proliferacao deste tipo celular. Em relacao a diferenciacao de HaCaT, os agonistas GW0742 e L-165,041 nao alteraram a expressao genica dos marcadores de diferenciacao celular queratina 14, queratina 1 e involucrina. Avaliando os niveis de expressao de mRNA de componentes da matriz extracelular da pele (colageno, fibronectina e colagenases), nao foram observadas alteracoes no padrao de expressao desses alvos apos a ativacao do PPAR¿À/¿Â em celulas HaCaT, ou apos a supressao da expressao do receptor em camundongos knockouts com estimulo de reparo de feridas cutaneas. Em resumo, neste trabalho foi desenvolvido um pipeline de selecao de agonistas para o PPAR¿À/¿Â que ativem e a estabilizem a estrutura do receptor, alem de possibilitar o calculo da constante de dissociacao entre as amostras testadas e a proteina. Por fim, foram acoplados ensaios a este pipeline para posterior caracterizacao dos agonistas de PPA (AU)