Estudo funcional dos microRNAs miR-450a e miR-450b-5p na tumorigênese

O câncer de ovário é a quinta maior causa de óbitos relacionados ao câncer em mulheres em todo o mundo, com pacientes tendo taxas de sobrevivência extremamente baixas. MicroRNAs (miRNAs) são RNAs não codificadores em torno de 22 ribonucleotídeos que desempenham um papel crítico na regulação da expressão gênica em praticamente todos os processos biológicos. Os miRNAs induzem o silenciamento de seus alvos através da repressão de tradução ou clivagem de mRNA. Neste trabalho verificamos que o miR-450a e o miR-450b-5p, dois miRNAs pouco explorados em tumores ginecológicos, foram regulados de forma negativa no câncer de ovário e nas linhagens de câncer de colo do útero. O objetivo deste trabalho foi verificar a hipótese de que tanto o miR-450a como o miR- 450b-5p atuam como supressores tumorais em cânceres de tecido reprodutivo. Para testar esta hipótese, utilizamos ensaios in vitro e um modelo xenográfico in vivo. Usando um vetor de expressão lentiviral, miR-450a e miR-450b-5p foram superexpressos de forma estável nas linhagens A2780, OVCAR-3 e SKOV-3 (linhagens tumorais de ovário) e C33 e SiHa (linhagens tumorais de câncer cervical). A taxa de anoikis foi analisada nas células submetidas a placas de baixa aderência durante 24 horas: a superexpressão de miR-450a resultou em menor viabilidade nas linhagens SiHa, OVCAR-3, A2780 e SKOV-3. Em relação à proliferação celular, as células A2780 que superexpressam o miR-450a proliferaram a uma taxa maior em comparação com as células controle. No entanto, no ensaio clonogênico essas células apresentaram menor número de colônias que eram visivelmente maiores. Por outro lado, o miR-450b diminuiu a taxa de proliferação na linhagem SKOV-3, o que foi corroborado no ensaio clonogênico. Também foram medidas as taxas de migração e invasão celular usando ensaio transwell. A superexpressão de miR-450a ou miR-450b-5p resultou em maior potencial de migração da linha celular C33, mas menor taxa de migração e invasão nas linhagens A2780 e SKOV3. Na linhagem OVCAR-3, a superexpressão do miR-450a aumentou o número de células capazes de invadir, já o miR-450b-5p induziu uma maior taxa de migração. A superexpressão do miR-450b-5p na linhagem SiHa resultou em menor potencial de invasão em comparação com o grupo controle correspondente. Após estes ensaios in vitro, decidimos continuar nossa análise apenas com células A2780 e SKOV-3, que apresentaram um padrão mais parecido nos ensaios. No ensaio in vivo, as células A2780 transduzidas foram injetadas intraperitonealmente em camundongos imunodeficientes de 9-11 semanas e, após 4 semanas, o peso de tumores recuperados foi comparado. Neste modelo xenográfico de câncer de ovário, verificamos que ambos os miRNAs diminuíram o crescimento tumoral, o que corrobora nossos ensaios in vitro. Também verificamos que a maioria dos alvos diretos encontrados por meio do método do PAR-CLIP e aqui validados do miR-450a estão relacionados ao metabolismo energético nas mitocôndrias (TIMMDC1, ACO2, ATP5B), além dos genes PAPSS1, CITED2, MAML1 e VIM, o marcador canônico do processo de EMT. O alvo direto para miR-450b, ME1, também está relacionado ao metabolismo energético. Até o momento, nossa análise verificou que o miRNAs miR- 450a e miR-450b-5p são comprovadamente relevantes para o processo tumorigênico de tumores epiteliais de ovário e agem como supressores tumorais principalmente pela regulação de genes que atuam no metabolismo energético. (AU)