Determinação dos sítios subcelulares de produção de espécies reativas de oxigênio e óxido nítrico em cultura de células musculares utilizando sondas fluorescentes e sua aplicação in vivo em combinação com a técnica de microdiálise: efeito dos ácidos graxos

Resumo

O tecido muscular produz espécies reativas de oxigênio (EROs) e óxido nítrico (NO) durante as concentrações. As EROs e NO exercem funções importantes no tecido muscular, como a regulação do fluxo sanguíneo, metabolismo de glicose, consumo de O2, angiogênese e na força de contração. Contudo, pouco se sabe sobre a formação intracelular dessas espécies reativas durante a atividade muscular. Além disso, evidências da produção dessas espécies in vivo são escassas devido principalmente a instabilidade dessas espécies e a falta de um método adequado a situação experimental. A proposta do presente estudo é de avaliar a participação das mitocôndrias, da enzima xantina oxidase (XO) e dos peroxissomos na produção subcelular de EROs e da enzima óxido nítrico sintase (NOS) na formação de NO durante contrações intensas in vitro utilizando cultura de células musculares. Para examinarmos a participação mitocondrial na produção de EROs, as células serão incubadas com as sondas fluorescentes 2,7-diclorodi-hidrofluoresceína-diacetato (DCFH-DA) e o marcador mitocondrial específico "MitoTracker Red". A participação da XO na produção intracelular de EROs será examinada através da incubação das células com a sonda DCFH-DA e com o inibidor da XO alopurinol. Ao passo que a participação dos peroxissomos será examinada pela incubação das células com ácidos graxos de cadeia longa (tais como palmítico e oleico) na presença do DCFH-DA. Para a identificação dos principais sítios subcelulares de produção de NO diferentes inibidores da enzima óxido nítrico sintase serão utilizados em conjunto com a sonda fluorescente 4,5-diaminofluoresceína-diacetato (DAF-2-DA). Em adição, a determinação de EROs e NO será realizada in vivo, utilizando ratos e humanos como modelos experimentais. A determinação de NO e H202 será realizada no meio intersticial através das sondas 4,5-diaminofluoresceína-Soro Albumina Bovina (DAF-2-BSA) e 2,7-diclorodi-hidrofluoresceína-Soro Albumina Bovina (DCFH-BSA) em combinação com a técnica de microdiálise. Nos experimentos in vitro, em culturas de células, e in vivo com ratos, a produção de EROs e ERN será induzida por estímulo elétrico intenso. Ao passo que, nos experimentos in vivo com humanos, a produção dessas espécies será estimulada por um protocolo de exercício intenso exclusivo ao músculo quadríceps femural. O efeito de ácidos graxos, que sabidamente aumentam no plasma durante a atividade física, será testado nesses experimentos. (AU)