Otimização de géis de eletroforese para análise e visualização de bandas esterásicas em diferentes tecidos de tilápias (Oreochromis niloticus) e cascudos (Pterygoplichthys anisitsi)

Resumo

Diferentes contaminantes ambientais podem causar alterações significativas na atividade de diversas esterases animais. Classicamente, pesticidas organofosforados e carbamatos, assim como metais pesados, são reconhecidos como grandes inibidores de esterases em animais, seja em experimentos de exposição em laboratório como em animais expostos no ambiente. Por este motivo, o estudo do grau de inibição de esterases em animais coletados em áreas com suspeitas de contaminação, tem sido utilizado como indicativo da presença destes compostos no ambiente. A grande maioria destes estudos baseia-se na medida da atividade de esterases tais como a acetilcolinesterase e carboxilesterase por cinética enzimática em espectrofotômetro. Mede-se assim a atividade de um conjunto de isoformas de uma determinada esterase com afinidade para o mesmo substrato usado no ensaio, presentes em um extrato protéico, e ao final comparam-se os dados obtidos para animais referência não expostos com os de animais tratados e/ou coletados em ambientes contaminados. Geralmente, uma inibição maior que 20% já pode ser considerada como decorrente da exposição a estes xenobióticos.Apesar de a inibição de esterases ser a resposta clássica em animais expostos a pesticidas organofosforados/carbamatos e/ou metais, muitas vezes é comum não se observar nenhum efeito ou ainda um efeito contrário, ou seja, um aumento significativo da atividade de esterases após exposição ao contaminante, principalmente após exposições curtas. Isto tem gerado uma série de discussões na literatura, sendo que diversas hipóteses para este comportamento têm sido propostas, tais como a de que em exposições curtas, a inibição da enzima causada pelo xenobiótico acarretaria numa imediata superexpressão da mesma no animal, para suprir esta inibição inicial. Após exposição prolongada, haveria então uma diminuição progressiva na atividade enzima. Devemos considerar que a maioria dos animais apresentam diversas isoformas de esterases com afinidade pelo mesmo substrato utilizado para as medidas de acetilcolinesterase (acetil-tiocolina) ou carboxilesterase (fenil-tioacetato), por exemplo. Pode ser que algumas isoformas pudessem ser mais expressas que outras, ou ainda que algumas das isoformas fossem inibidas sem haver aumento de expressão, após um determinado período de exposição a um xenobiótico. Neste caso, ao medirmos o conjunto destas isoformas espectrofotometricamente, estaríamos de certa forma mascarando o efeito real causado pelo xenobiótico no organismo. Um animal exposto a um pesticida organofosforado por 2 dias, por exemplo, e cuja atividade de carboxilesterase não se apresentasse alterada quando comparada a um animal controle, poderia na verdade apresentar algumas isoformas superexpressas enquanto que outras inibidas. O conjunto total de atividade medida neste caso seria igual ao encontrado no controle, mas a situação real para distintas isoformas poderia ser bastante diferente. Uma forma de se estudar se isso ocorre de fato, seria através da visualização de bandas esterásicas em géis de eletroforese. Esta técnica baseia-se na separação das esterases de um extrato protéico em um gel de eletroforese, e posterior visualização das bandas correspondentes a esterases após tratamento do gel com a- ou b-naftil acetato e coloração com Fast blue. Este procedimento permite-nos identificar o número total de bandas esterásicas nos girinos, assim como monitorar diferenças de intensidade das bandas observadas entre animais controle e tratado. Dependendo do número de bandas que forem identificadas, este método também permite-nos identificar quais das diferentes esterases são mais ou menos sensíveis aos tratamentos com os pesticidas.Assim, este projeto tem como finalidade principal, padronizar métodos de separação de diferentes esterases em géis de poliacrilamida, em diferentes tecidos (fígado, brânquias e cérebro) de peixes (Oreochromis niloticus e Pterygoplichthys anisitsi).