Entrada capacitiva de cálcio em células de Leydig de camundongos

Resumo

O hormônio testosterona, nos machos, é produzido pelas células de Leydig. Sua produção e secreção encontram-se sob controle do Hormônio Luteinizante, cuja ação envolve aumentos na concentração de AMPc e cálcio intracelulares. Ambos parecem atuar ativando a "Steroidogenic Acute Regulatory Protein" (STAR), responsável pelo transporte de colesterol através da membrana interna da mitocôndria. Dados de nosso laboratório têm demonstrado a presença em células de Leydig de pelo menos dois sistemas que poderiam ser responsabilizados pela entrada de cálcio ao intracelular: 1) receptores ativados por ATP do tipo P2X, que, sabidamente, possuem alta permeabilidade a cálcio e 2) canais para cálcio do tipo T, presentes na membrana plasmática e ativados por LH. Embora tenhamos evidências de que esse último sistema seja o principal envolvido no processo de elevação da concentração de cálcio, quando ocorre estimulação da célula por LH, há indícios de que o esvaziamento do retículo possa também ativar a chamada entrada capacitiva de cálcio ("Store Operated Calcium Entry" (SOCE)). A identidade molecular dessa via só foi revelada muito recentemente e parece envolver proteínas da família ORAI (que formariam o canal) e STIM (que acopla o sinal de esvaziamento do retículo a ORAI). Assim sendo, a proposta deste projeto visa identificar e caracterizar tal via de entrada em células de Leydig de camundongos. Para tanto, pretende-se utilizar dois tipos básicos de experimentos: 1) medidas de correntes de cálcio com a técnica de "patch clamp" (as células serão incubadas na ausência de cálcio na solução externa e o retículo, esvaziado por tratamento com IP3 , seguindo o aparecimento da SOCE via aplicação de uma rampa de voltagem a cada 2 segundos) e 2) determinação da atividade intracelular de cálcio utilizando-se marcadores fluorescentes do íon e microscopia confocal, também em condições onde o retículo será esvaziado por diferentes tratamentos impostos às células, na ausência e presença de cálcio externo. Espera-se, com isso, caracterizar esse tipo de via de entrada de cálcio e correlacioná-la com os efeitos do LH sobre as células de Leydig.