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Estabelecimento de linhagens celulares com expressão permanente de EGFP-Bax, DsRed-Bax, EGFP-Bcl-xL e Pericams

Processo: 07/00257-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de maio de 2007
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2008
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Farmacologia - Farmacologia Bioquímica e Molecular
Pesquisador responsável:Soraya Soubhi Smaili
Beneficiário:Mari Luminosa Muler
Instituição-sede: Departamento de Farmacologia. Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Transdução de sinais   Morte celular   Apoptose   Linhagem celular   Mitocôndrias   Cálcio   Modelos animais

Resumo

O Ca2+ é um importante sinalizador de diversas funções celulares bem como da sinalização apoptótica (Smaili et al, 2003). A homeostase do Ca2+ é mantida através de bombas e transportadores, por proteínas que se ligam ao Ca2+, sendo que o íon é armazenado em diferentes estoques intracelulares tais como retículo endoplasmático, mitocôndria, golgi entre outros. Alterações na homeostase e nos estoques de cálcio parecem ser fatores determinantes no controle da apoptose (Rizzuto e Pozan, 2006). A apoptose pode ser regulada por diferentes fatores tais como as proteínas da família Bcl-2, a qual é formada tanto por proteínas pró-apoptóticas (e.g. Bax, Bad e Bid entre outras) quanto por proteínas anti-apoptóticas (e.g. Bcl-2 e Bcl-xL) (Smaili et al, 2003). A Bax é encontrada predominantemente no citosol como proteína monomérica solúvel e em pequena proporção associada à mitocôndria. Sob estímulo apoptótico sofre uma alteração conformacional que leva à sua translocação para a mitocôndria e retículo endoplasmático (Antonsson, 2004). Estudos em nosso laboratório, mostraram que durante a translocação da Bax e na presença de um estímulo apoptótico, pode haver liberação de cálcio de estoques intracelulares. Além disso, agonistas que mobilizam estes estoques também são capazes de induzir à translocação. Para esclarecermos os mecanismos envolvidos na relação entre a mobilização de cálcio de estoques intracelulares e a translocação da Bax, é de fundamental importância criar condições para a realização de medidas mais específicas da origem intracelular do cálcio liberado (mitocôndria, retículo endoplasmático e núcleo). Assim, o objetivo do presente trabalho será estabelecer linhagens celulares com expressão permanente e estável de EGFP-Bax, DsRed-Bax, EGFP-Bcl-xL e Pericams mitocondrial e nuclear que possibilitarão as medidas simultâneas de translocação e cálcio por microscopia de fluorescência em tempo real. As transfecções serão feitas em astrócitos imortalizados de rato, cuja linhagem será desenvolvida, e em linhagem estabelecida de células MCF-7 (células de adenocarcinoma de mama humano).

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