Obtenção e caracterização das metacaspases: participação destas enzimas na morte celular

Resumo

Metacaspases são peptidases de eucariotos inferiores similares às caspases, que são peptidases que participam do processo de morte celular em mamíferos. Experimentos de viabilidade celular demonstraram que elas, assim como as caspases em mamíferos, estão intimamente correlacionadas com a morte celular nestes organismos. As análises das estruturas primárias sugerem que as metacaspases possuem estrutura terciária similar à das caspases. Do ponto de vista da especificidade por substrato as caspases possuem afinidade por resíduos de ácido aspártico na posição P1, além de importantes interações com os resíduos P2, P3 e P4, de maneira que existem substratos disponíveis capazes de diferenciar as diferentes caspases. Porém, as metacaspases possuem uma especificidade por resíduos de arginina na posição P1 e até o momento existem poucos estudos sobre a especificidade por substrato dessas enzimas. Neste projeto pretendemos investigar substratos com supressão intramolecular de fluorescência e com estes substratos caracterizarmos bioquimicamente metacaspases de Saccharomyces cerevisiae, Aspergíllus fumigatus, Trypanossoma brucei e Leishmania amazonensis. Iniciaremos por substratos fluorogênicos com a seqüência de aminoácidos referentes à porção da pro - região destas enzimas que precisam ser hidrolisadas para que as mesmas sejam ativadas, pretendemos realizar ensaios com esses substratos fluorogenicos para determinarmos quais as possíveis peptidases que estão envolvidas na ativação destas metacaspases. Faremos também o estudo da especificidade usando bibliotecas de peptídeos ligados a resinas para identificarmos seqüências suscetíveis a hidrolise e tentar deduzir possíveis substratos naturais. Os substratos desenvolvidos para as metacaspases serão utilizados para avaliarmos em preparação celulares, a participação destas peptidases na apoptose, que pode facilitar muito o processo de fenotipagem em diferentes cepas "selvagens" e manipuladas geneticamente. Além disso, poderemos abordar propriedades funcionais das metacaspases controladas pelo ambiente, tais como sais, ativadores. temperatura e inibidores. (AU)