Produção de ArtinM recombinante nas formas oligomérica e monomérica: estudo estrutural e análise comparativa de atividades.

Resumo

ArtinM é uma lectina presente em sementes de jaca, que se liga especificamente a D-manose, diferentemente do seu homólogo Jacalina, ligante de D-galactose. Na forma nativa, ArtinM apresenta-se como um homotetrâmero de massa molecular aparente de 52kDa, resultante da associação não-covalente de 4 subunidades do monômero de 13kDa. Nas últimas duas décadas foram descritas importantes atividades biológicas de ArtinM, principalmente ligadas à modulação e regulação das respostas imune inata e adaptativa, denotando-se um grande potencial terapêutico para essa proteína. Dentre tais atividades, destacamos a capacidade de induzir in vitro a migração de neutrófilos através de mecanismo haptotático, primordialmente devido sua ligação ao receptor CXCR2 e a secreção de IL-12 por macrófagos em decorrência da sua ligação ao receptor TLR2. Em modelos in vivo, observamos que a administração da lectina leva a detecção de altos níveis de IL-12 e IFN-³, e níveis moderados de IL-10, caracterizando a ocorrência de uma resposta Th1 modulada que propicia resistência a infecções por microorganismos de parasitismo intracelular, como as causadas por Leishmania e Paracoccidioides brasiliensis. Definiu-se assim a propriedade imunomoduladora de Artin M. Além disso, Artin M promove a regeneração de tecido do epitélio córneo, com característico aumento do influxo de neutrófilos à região lesada. A relevância desse conjunto de propriedades conduziu à obtenção de ArtinM em larga escala, na forma recombinante. A proteína purificada a partir da expressão em E.coli apresentou-se, exclusivamente, na forma monomérica e algumas das atividades de ArtinM exigem a forma oligomérica da lectina. Sendo assim, torna-se necessário investimento em novas construções recombinantes a fim de obter formas oligoméricas da proteína e avaliar os mecanismos envolvidos na modulação da resposta imune pelas diferentes variáveis estruturais.Este projeto tem como objetivo principal desenvolver meios para obter ArtinM recombinante na forma oligomérica, seja na forma de dímero e/ou, principalmente, na forma de tetrâmero. Assim, serão atividades desenvolvidas no decorrer do projeto:- Expressão heteróloga em diferentes vetores, especialmente leveduras- Expressão em E. coli e utilização de um "linker" para unificar monômeros.- Ensaio de ligação da lectina recombinante (monomérica ou oligomérica) a glicanas (glycoarray) para validar a especificidade de ligação a manose (e não a galactose), bem como a ligantes mais complexos (oligossacarídeos, glicoproteínas) que contenham manose; a comparação com as propriedades da forma nativa, permitirá inferir a existência de um CDR (domínio de ligação a carboidrato) intacto e ativo.- Ensaios in vitro para confirmar e caracterizar as atividades biológicas das diferentes formas estruturais da molécula.- Estudos estruturais para a caracterização das moléculas recombinantes.