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Identificação dos genes das enterotoxinas A, B e E de Staphylococcus aureus isolados de queijos manipulados em Jaboticabal

Processo: 07/03537-4
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de dezembro de 2007
Vigência (Término): 30 de novembro de 2008
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Inspeção de Produtos de Origem Animal
Pesquisador responsável:Oswaldo Durival Rossi Junior
Beneficiário:Reinaldo Juan Garrido Palacios Junior
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Jaboticabal. Jaboticabal , SP, Brasil
Assunto(s):Microbiologia de alimentos   Queijo   Staphylococcus aureus   Enterotoxinas   Genes

Resumo

São freqüentes os surtos de intoxicação alimentar provocados por Staphylococcus aureus enterotoxigênico veiculados por leite e seus derivados, os quais desempenham um papel nutricional importante para o homem. S. aureus produz enterotoxinas estafilocócicas (SEs) termoestáveis, sendo conhecidas: SEA-SEE, SEG-SEM., SEU; além de outras exotoxinas: toxina da síndrome do choque tóxico (TSST-1) e toxina exfoliativa (ETA e ETB); onde todos os genes dessas exotoxinas foram documentados. Este trabalho tem por objetivo identificar as enterotoxinas A, B e E de S. aureus isolados de queijo Minas Frescal caseiros no município de Jaboticabal. Espera-se com esse trabalho favorecer os diagnósticos de SEs, com o uso da PCR como método alternativo para rápida, sensível e específica detecção de exotoxina clinicamente importante, auxiliando na prevenção de casos de intoxicação alimentar, com informações científicas e contribuindo com a melhoria da Saúde Pública. Para isso, serão feitas colheitas de 30 amostras de queijo em mercados do município, preparando diluições com 25 gramas de cada amostra que serão homogeneizadas com água peptonada (225 mL) e esterelizada (0,1%). Para a identificação 0,1 mL de cada diluição será depositada em placas de ágar que serão incubadas a 35ºC por 24-48 horas. Identificar-se-ão 20 colônias típicas de cada amostra, semear-se-ão-as em tubos com ágar nutriente inclinado e estas incubadas a 35ºC por 24 horas. Pelo método de Gram preparar-se-ão esfregaços, onde os cocos Gram-positivos em forma de cacho de uva serão submetidos à prova de catalase para confirmação do gênero, e conseguintemente às provas da coagulase livre, fermentação do manitol em anaerobiose, da produção de acetoína (VP) e de termonuclease, para identificação da espécie. Para extração de DNA será usado o quite Instagene Matrix. Das amostras selecionas realizar-se-á a extração do DNA das estirpes de S. aureus que serão analisadas por PCR, onde cada amostra será submetida a duas amplificações distintas em tubos separados de PCR. A amplificação por PCR será realizada com volume total de 50 µl onde inclui-se: DNA alvo, Taq DNA polimerase, MgCl2, mix dNTP, cada primer. A amplificação será feita em um termociclador automatizado, onde os ciclos térmicos serão: primeiro ciclo de 94ºC por 4 min; desnaturação a 94ºC por 2 min, pareamento a 55ºC por 1 min e 30" e extensão a 72ºC por 1 min e 30"; segundo ciclo com desnaturação a 94ºC por 2 min, pareamento a 53ºC por 1 min e 30" e extensão a 72ºC por 1 min e 30"; e terceiro ciclo com pareamento a 51ºC com 37 ciclos adicionais com 94ºC por 2 min, pareamento a 51ºC por 1 min e 30" e extensão a 72ºC por 1 min e 30". No final dos ciclos os tubos serão incubados a 72ºC por 7 min e estocados a 4ºC. Haverá a analise através da corrida eletroforética em gel de agarose a 1,5% (m/v) corados com Brometo de Etídio sob luz UV de 254 nm. Os resultados serão digitalizados.

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