Caracterização da ORF essencial YMR134W de função desconhecida -envolvimento na resposta antioxidante e no metabolismo de ferro em Saccharomyces cerevisiae.

Resumo

Saccharomyces cerevisiae teve seu sequenciamento genômico terminado em 1996, sendo composto de cerca de 6300 ORFs ("open reading Frames") distribuídas em 16 cromossomos, das quais aproximadamente 20% estão anotadas como não caracterizadas e de função molecular desconhecida. Com o objetivo de caracterizar algumas dessas ORFs essenciais à levedura, que estejam relacionadas aos processos antioxidantes, foi adquirida uma coleção a qual possui linhagens de mutantes termossensíveis para genes essenciais de Saccharomyces cerevisiae. Inicialmente buscamos os genes de levedura anotados como função molecular e biológica desconhecidas, cuja deleção resultava em células inviáveis, usando o site Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). Essa busca resultou em 36 ORFs, sendo que 14 linhagens estavam presentes na nossa coleção de termossensíveis. Após a escolha dos genes candidatos foram realizados testes de viabilidade para seleção de ORFs relacionadas à resposta antioxidante. Testes na presença de peróxido de hidrogênio, tert butil hidroperóxido ou luz ultravioleta (UV) relacionaram o gene YMR134W com a resposta antioxidante, cuja linhagem mutante se mostrou unicamente sensível ao peróxido de hidrogênio. O objetivo desse projeto é estudar a função biológica e molecular de YMR134W na resposta antioxidante, investigando seu padrão de expressão gênica, sua estrutura terciária e, se possível, caracterizar sua atividade bioquímica. Para isso clonaremos e expressaremos esse gene em E. coli, purificaremos a proteína e realizaremos testes de atividade, ensaios de cristalografia, além de produzirmos anticorpos para análises da expressão e localização da proteína in vivo. Investigaremos ainda seu envolvimento no metabolismo mitocondrial de ferro, já que alguns dados da literatura relacionam os mutantes de YMR134W com esse processo celular.