Administração cutânea de RNAs interferentes para o tratamento de patologias da pele

Resumo

A descoberta revolucionária do silenciamento da expressão gênica pelo mecanismo de Interferência de RNA (RNAi) atraiu grande atenção como nova abordagem terapêutica contra doenças crônicas e severas. RNAi é um processo pós-transcricional no qual RNAs interferentes (siRNAs) induzem o silenciamento da expressão gênica de forma eficaz e específica. siRNAs consistem em segmentos de RNA de fita dupla contento 21-23 pares de bases e 2 nucleotídeos desemparelhados nas extremidades 3-linha; de cada fita. O processo de RNAi pode ser alcançado tanto pela introdução de siRNAs sintetizados quimicamente como por expressão endógena de siRNAs no núcleo. Entretanto, obstáculos na administração e distribuição in vivo comprometem a potencialidade terapêutica de siRNAs, fazendo com que o desenvolvimento de sistemas de liberação seja um fator-chave para transformar o uso terapêutico de siRNAs em realidade. Por outro lado, a flexibilidade no design de lipídeos polares e composição de sistemas lipídicos, diversidade de métodos de preparo e a eficiência de liberação in vivo são alguns dos fatores que propiciaram o uso de sistemas lipídicos para a administração de material genético em humanos. Paralelamente, a liberação tópica de siRNAs surge como uma alternativa promissora para o tratamento de patologias cutâneas por promover o efeito farmacológico somente no local desejado, evitando-se a ocorrência generalizada de reações adversas inerentes à administração sistêmica. Considerada uma citocina pró-inflamatória primária, o fator de necrose tumoral (TNF-alfa) tanto é produzido como exerce seus efeitos em todas as células da pele. A expressão exacerbada de TNF-alfa na epiderme provoca infiltração de células inflamatórias, espessamento do estrato córneo, descamação e necrose. A superprodução crônica de TNF-alfa na pele e articulações é associada a processos inflamatórios crônicos como psoríase, psoríase artrítica e artrite reumatóide. Apesar de ainda não ter sido demonstrada, a liberação cutânea de siRNAs parece bastante promissora, uma vez que existem trabalhos relatando que é possível administrar oligonucleotídeos e DNA plasmidial na pele de forma eficiente e sem perda da funcionalidade. Administrar siRNAs na pele como nova abordagem terapêutica contra patologias cutâneas. (1) Desenvolvimento e caracterização de sistemas lipídicos: -Complexação de siRNAs sintetizados quimicamente com lipídeos polares (DOTMA, DOTAP e/ou oleilamina) ou adição de promotor de absorção (monoleína) à formulação; -Caracterização físico-química dos complexos siRNA/lipídeos para determinar i) tamanho de partícula (espalhamento dinâmico de luz); ii) razão de cargas (+/-) (potencial zeta) e iii) formação de fases líquido-cristalinas: (SAXS). (2) Investigação da penetração cutânea de siRNAs: -Avaliação in vitro da penetração cutânea de siRNA marcado com sonda fluorescente (FAM-siRNA) a partir de diferentes formulações em células de difusão Franz usando modelo de membrana biológica; -Avaliação in vivo da toxicidade e penetração cutânea de FAM-siRNA usando modelo de camundongo sem pelo e microscopia confocal a laser. (3) Investigação da funcionalidade de siRNAs contra TNF-alfa na pele: -Avaliação in vivo do silenciamento da expressão de TNF-alfa mediada por siRNA por ELISA e Real Time RT-PCR. Determinação da influência de i) diferentes seqüências de siRNA; ii) concentração; iii) intervalo de tempo e, iv) especificidade. (4) Investigação do efeito de silenciamento da expressão de TNF-alfa mediado por siRNA sobre processo de inflamação cutânea induzido por 12-O-tetradecanoilforbol-13 acetato (TPA). JUSTIFICATIVA: a realização destes estudos fornecerá a base para o entendimento e aplicação de siRNAs como agentes terapêuticos no tratamento de patologias cutâneas graves, como a psoríase, dermatose de origem autoimune ainda sem tratamento eficaz. (AU)