Clonagem e Expressão das calicreínas teciduais humanas KLK1 e KLK6, e de uma serpina do Sphenophorus Levis.

Resumo

As calicreínas teciduais humanas hK1 e hK6 fazem parte de um subgrupo de serino proteases presentes em diversos tecidos, e associadas a uma série de processos fisiológicos. A hK1 é conhecida principalmente por sua atividade frente ao cininogênio de baixa massa molecular, levando a liberação de lisil-bradicinina (calidina). Quanto a hK6, alguns estudos indicam que esta enzima pode estar envolvida no desenvolvimento de doenças neurodegenerativas e na clivagem de plasminogênio para liberação de angiostatina e fragmentos de angiostatina in vitro. Neste projeto temos como objetivo a clonagem e expressão destas duas enzimas. Para isso, pretendemos amplificar os genes KLK1 e KLK6 a partir de um painel de cDNA de múltiplos tecidos. Posteriormente, estes genes serão subclonados no vetor de expressão pET28a(+) e transformados em células de E. coli da linhagem DH5α, para a confirmação da correta seqüência do gene. Após a identificação dos genes como sendo KLK1 e KLK6, o vetor será transformado em células de E. coli da linha rosetta para a expressão das enzimas. A purificação destas enzimas será feita em colunas de níquel e suas massas moleculares serão determinadas por eletroforese. Futuramente essas enzimas serão utilizadas na produção de anticorpos monoclonais, os quais serão úteis em estudos de dosagem das calicreínas 1 e 6 em tecidos normais e patológicos.