Sequenciamento do quadro aberto de leitura e identificação de isoformas de três genes da via da lignificação em Panicum maximum e Brachiaria Brizantha

Resumo

Várias estratégias vêm sendo desenvolvidas para aperfeiçoar a composição da parede celular de plantas para melhorar o seu uso agro-industrial. Com relação ao uso de forragens na alimentação animal, a lignificação da parede celular que ocorre com o avanço da maturidade é o grande limitante à produtividade da pecuária. Apesar da importância das pastagens para a produção de ruminantes no Brasil, não existe nenhum estudo publicado envolvendo a alteração da síntese de lignina em forrageiras tropicais. Várias plantas de clima temperado, como tabaco, arabidopsis, alfafa e milho já sofreram alterações na expressão de enzimas envolvidas com a síntese deprecursores da lignina (monolignóis) que resultou em menores teores de lignina e maior digestibilidade ruminal. Recentemente, os genes caféico O-metiltransferase (COMT), fenilalanina amônio liase (PAL) e cinamato 4-hidroxilase (C4H) foram identificados como correlacionados com a queda da digestibilidade da parede celular do colmo de P. maximum. Nossos objetivos com este projeto são sequenciar o quadro aberto de leitura dos genes COMT, PAL e C4H nas gramíneas P. maximum e B. brizantha; identificar isoformas destes genes e quantificar a expressão das mesmas durante o desenvolvimento das gramíneas; gerar conhecimento para experimento futuro de engenharia genética visando a redução da expressão dos genes responsáveis pela síntese da lignina em gramíneas. Para tanto, as gramíneas serão colhidas com 30, 60 ou 90 dias de crescimento e o RNA total será utilizado em reações de amplificação rápida de terminais livres de cDNA (RACE) utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores específicos definidos com base em seqüências de P. maximum já disponíveis em bancos de dados. Após a amplificação, o produto de nested-PCR será inserido em células competentes e seqüenciado. A existência de isoformas dos genes será verificada através da visualização de bandas de tamanhos diferentes e também por hibridização do RNA com sondas específicas (northern blot). As diferentes isoformas encontradas serão seqüenciadas e seus perfis de expressão no colmo das gramíneas serão quantificados por PCR em tempo real. As amostras coletas serão caracterizadas quanto ao teor de lignina e digestibilidade da parede celular de modo aidentificar quais as isoformas relacionadas com a queda da digestibilidade do colmo. O seqüenciamento do quadro aberto de leitura destes genes, bem como a identificação das isoformas responsáveis pela queda da digestibilidade, irão auxiliar o desenvolvimento de projetos futuros de engenharia genética para geração de plantas transgênicas com menor expressão destes genes. A maneira mais usual de knock out de genes em gramíneas é a colocação do quadro aberto de leitura do gene de interesse, na direção senso e antisenso, sob o controle do promotor de ubiquitina de milho.(AU)