Caracterização genotípica de cepas de Fonseca pedrosoi por RFLP

Resumo

A cromoblastomicose é uma doença endêmica no Brasil, principalmente na zona rural, e é causada pela Fonsecaea pedrosoi e outros fungos demácios. Esses fungos apresentam significativo pleomorfismo o que pode dificultar a sua identificação. Recentemente desenvolvemos um método de PCR-duplex para detecção de F. pedrosoi util para a identificação de cepas com características morfologias inespecíficas ou mesmo detectar o agente diretamente em amostras biológicas. Outros métodos moleculares têm sido utilizados para a caracterização genotípica de cepas de fungos demácios para fins epidemiológicos e taxonômicos. O método de PCR-RFLP dirigido para a região genômica IT1-5.8S-ITS2-28S (ITS-RFLP) tem sido utilizado para detectar perfis de fragmentos de DNA caracteristicos (Fingerprinting) para diferenciação de espécies de fungos demácios. O presente estudo tem por objetivo a caracterização genotípica por RFLP de cepas de F. pedrosoi isoladas de pacientes com cromoblastomicose provenientes de diferentes regiões do Brasil. Também serão estudadas as relações entre os perfis de RFLP e as características fenotípicas em cepas isoladas durante o tratamento com itraconazol e os perfil de sensibilidade a antifúngicos in vitro. Serão estudadas cepas F. pedrosoi provenientes de diversas localidades do Brasil (n=40) e isoladas de pacientes em diferentes períodos de tratamento com itraconazol ou outros antifúngicos (n=40). Também serão avaliadas cepas de outros fungos demácios (n=20) com a finalidade de comparar os perfis de RFLP com o de F. pedrosoi. A identificação morfológica das cepas será realizada por técnica de microcultivo e o perfil de sensibilidade a antifúngicos será avaliado pelo método de microdiluição em caldo preconizado pelo NCCLS. O DNA genomico das cepas será extraído por método de extração com CTAB e a identificação molecular será realizada por PCR-duplex, métodos previamente otimizados no nosso laboratório. A caracterização genotípica das cepas será realizada por PCR-RFLP utilizando-se as enzimas de restrição DdeI e TaqI e os perfis diferentes serão também avaliados por sequenciamento de DNA. Os resultados deste estudo contribuirão para o conhecimento da diversidade genética de isolados de F. pedrosoi oriundos de diferentes regiões geográficas do Brasil e permitirá avaliar a sua relação com a variabilidade morfológica durante o tratamento com itraconazol in vivo e com o perfil de sensibilidade a antifúngicos in vitro.