Engenharia molecular no desenvolvimento de b-glicosidases GH1 de alto desempenho para aplicação em coquetéis enzimáticos celulolíticos visando a sacarificação eficiente da celulose de resíduos agroindustriais

Resumo

Na natureza, a degradação enzimática da celulose até glicose é conduzida pela ação sinérgica das celulases. Dentre estas, as b-glicosidases desempenham um papel crucial na cascata de despolimerização da celulose, catalisando a hidrólise da celobiose em monômeros de glicose. Essa atuação é essencial para mitigar o efeito inibitório da celobiose sobre as atividades das endoglucanases e celobiohidrolases. No entanto, a inibição pela glicose é o fenômeno mais comumente observado entre as b-glicosidases. Assim, destacando a importância de se estudar b-glicosidases tolerantes à glicose para o desenvolvimento de um coquetel enzimático celulolítico (CEC) otimizado e que atenda às exigências industriais. Neste contexto, esta pesquisa propõe soluções sustentáveis para a gestão de resíduos agrícolas, focando na produção de açúcares fermentescíveis. Para isso, o estudo visa desenvolver e explorar o potencial biotecnológico de novas b-glicosidases da família GH1 derivadas do fungo Trichoderma RP698, criadas através de engenharia de proteínas. Essas enzimas serão avaliadas para melhorar a eficiência na sacarificação de celulose de agro-resíduos, utilizando CECs termoestáveis. Os objetivos principais incluem a criação de b-glicosidases GH1 altamente eficazes, termoestáveis e capazes de tolerar altas concentrações de glicose, empregando tanto metodologias racionais quanto irracionais de engenharia molecular. A metodologia racional adotada envolverá mutagênese sítio-dirigida baseada em informações estruturais de enzimas homólogas e focará na tolerância à glicose; já a abordagem irracional será feita para termoestabilidade via evolução dirigida "in vitro" por técnicas padronizadas de mutagênese aleatória por epPCR (PCR propensa a erros) e DNA shuffling (embaralhamento de DNA). Espera-se que a associação destas estratégias moleculares, obtenha-se b-glicosidases com desempenho superior em altas temperaturas e concentrações de glicose, além de informações estruturais e funcionais sobre os fatores bioquímicos que influenciam sua atividade. Para tal, serão realizadas análises bioquímicas e biofísicas para compreender as propriedades dos mutantes. Desta forma, as enzimas mais promissoras serão selecionadas e sua eficiência avaliada em CECs durante a hidrólise de agro-resíduos pré-tratados. Ao final, após um mapeamento das melhores mutações, será feita mutagênese pontual obtendo uma nova e potencial b-glicosidase GH1 gluco-termotolerante que englobará todas as características desejadas. Com o sucesso deste projeto, que será associado ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (INCT - 2024/50884-5), espera-se um avanço científico significativo no desenvolvimento de enzimas destinadas à indústria de biorrenováveis, além de promover a sustentabilidade e a eficiência no uso ecológico de agro-resíduos.