Estudos estruturais e bioquímicos de LPMOs AA9 recombinantes de basidiomicetos

Resumo

As monooxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs) são enzimas dependentes do cobre que executam uma clivagem oxidativa das ligações glicosídicas. O raro e notável sítio ativo dos LPMOs é composto por um único átomo de cobre coordenado por três ligantes de nitrogênio, um motivo estrutural conhecido como histidine brace. Os ligantes de nitrogênio são fornecidos pelo grupo amino e pela cadeia lateral de uma His N-terminal, e um terceiro vem de outra cadeia lateral de histidina, dando origem a uma geometria de coordenação de cobre em forma de T. A identificação da atividade dos LPMOs e sua cooperatividade com as enzimas hidrolíticas clássicas foi uma mudança paradigmática na conversão enzimática de polissacarídeos lignocelulósicos, especialmente para a viabilidade das biorrefinarias. Atualmente, sabe-se que os LPMOs estão presentes nos genomas de vírus e muitos táxons em toda a árvore da vida, e são classificados nas famílias AA9, AA10, AA11, AA13, AA14, AA15, AA16 e AA17 na base de dados CAZy (Carbohydrate-Active enZymes) (cazy.org). Os membros da família AA9 (LPMO9s) são exclusivos e amplamente distribuídos entre fungos com diferentes estilos de vida. Neste sentido, enquanto alguns basidiomicetos de podridão branca excedem 30 genes codificadores de LPMO9s, ascomicetos onipresentes como Neurospora crassa e Aspergillus spp. possuem cerca de 15 e 8 genes, respectivamente. A co-expressão/secreção diferencial de LPMO9s juntamente com outras enzimas que degradam a parede celular vegetal foi verificada em resposta ao substrato, especialmente materiais lignocelulósicos. Estudos funcionais revelaram que os LPMO9s são ativas não apenas em celulose e celloligosacarídeos, mas também em uma variedade de substratos hemicelulósicos. Entre eles, a atividade sobre xyloglucano de tamarindo é a mais comumente verificada. O número de LPMO9s preditas nos genomas de basidiomicetos é muito maior do que em ascomicetos, no entanto, estudos funcionais sobre especificidade ao substrato e regioseletividade ainda são limitados. De acordo com o banco de dados CAZy, três LPMOs de fungos da podridão branca como Heterobasidion irregulare, Lentinus similis e Phanerochaete chrysosporium, e dois da podridão parda (Gloeophyllum trabeum) foram caracterizados até o momento. Neste trabalho, uma abordagem proteômica será utilizada para investigar o arsenal enzimático de CAZymes de Picnoporus coccineus e Trametes versicolor, com foco na busca por novas AA9 LPMOs. Para isso, o crescimento e o padrão de secreção de proteínas de ambos fungos de podridão branca serão investigados em diferentes substratos lignocelulósicos . Os resultados obtidos permitirão um entendimento global das estratégias empregadas por esses microrganismos na degradação de diferentes substratos lignocelulósicos e permitir o levantamento de uma série de LPMOs alvo para produção utilizando a cepa A. oryzae, juntamente com estudos bioquímicos e estruturais.