Construção estratégica de uma biblioteca gênica para evolução dirigida/design semi-racional de enzimas: em busca da compreensão do reconhecimento de substratos e da otimização da especificidade enzimática

Resumo

A engenharia de enzimas é uma ferramenta valiosa para otimização de processos no campo da biocatálise. Entre as estratégias atuais, a evolução dirigida e o design semi-racional surgem como abordagens poderosas, em comparação com o design racional, quando há informações limitadas sobre as relações estrutura-função da enzima-alvo. Além disso, essas abordagens permitem a rápida avaliação de vastas bibliotecas de variantes, sendo ótimas ferramentas para superar desafios complexos, como a modulação da especificidade de uma enzima com o objetivo de reduzir sua promiscuidade de substratos. Neste projeto, propomos aplicar a evolução dirigida e o design semi-racional para otimizar a enzima CalB, uma coniferaldeído desidrogenase de Pseudomonas sp. HR199 que pode ser utilizada na via de bioconversão do eugenol para vanilina. Apesar desta aplicação potencial, CalB - que atua na etapa intermediária de conversão do coniferaldeído para ácido ferúlico - também reconhece o produto alvo, vanilina, como um substrato. Embora esta característica atualmente limite a aplicação de CalB, tentar modular sua especificidade de substrato através da engenharia enzimática poderia permitir seu uso na produção sustentável e eficiente de vanilina. No entanto, direcionar a especificidade de CalB para o coniferaldeído e também mitigar sua atividade contra a vanilina é uma tarefa desafiadora para ser alcançada de forma ótima apenas através do design racional, dada a similaridade estrutural da vanilina e do coniferaldeído. Diante desses desafios, bem como da ausência de estruturas de alta resolução para desidrogenases ativas em coniferaldeído/vanilina, e da dificuldade em obter a estrutura cristalográfica de CalB, o estabelecimento de uma biblioteca gênica para evolução dirigida e design semi-racional de enzimas surge como uma estratégia fundamental. Esperamos que a triagem de um número significativamente maior de variantes melhore consideravelmente as perspectivas de adquirir uma variante promissora com atividade otimizada em relação ao coniferaldeído e que não seja ativa contra a vanilina como substrato. Adicionalmente, esses experimentos devem proporcionar uma melhor compreensão das relações estrutura-função que regem a seletividade de substratos pelas enzimas. Além disso, esta proposta de BEPE abrange tanto um entregável que contribuirá para o projeto de doutorado quanto uma experiência imersiva de aprendizado, fornecendo as habilidades necessárias para aprimorar a expertise de nosso grupo incorporando o conhecimento da técnica de evolução dirigida de enzimas.