Caracterização estrutural e bioquímica das enzimas antioxidantes AfPrx1 e AfPrxC do micopatógeno humano Aspergillus fumigatus

Resumo

Aspergillus fumigatus é um micopatógeno capaz de causar a aspergilose pulmonarinvasiva (IPA), uma infecção pulmonar sistêmica grave com altas taxas de mortalidade.Para infecções bem-sucedidas, A fumigatus necessita lidar com o insulto oxidativoimposto pelo hospedeiro. As peroxirredoxinas (Prxs) são tiól peroxidases abundantes ealtamente eficientes para decompor peróxidos, tendo um importante papel nadesintoxicação e resposta de patógenos frente ao estresse oxidativo gerado pelohospedeiro. Em colaboração com o grupo do Dr. Iran Malavazi (UFSCAR), mostramosque AfPrx1 está envolvida na virulência deste fungo, possivelmente por meio da reduçãode hidroperóxidos, incluindo H2O2 gerados pelo hospedeiro. Outra Prx de A. fumigatusé a AfPrxC que está presente nas mitocôndrias, enquanto AfPrx1 está no citosol. Ambas,AfPrx1 e AfPrxC, são 1-Cys Prx, ou seja, dependem de um único resíduo de cisteína paraa atividade catalítica. A Dra Renata Fernandes caracterizou aspectos bioquímicos eestruturais de AfPrx1 e AfPrxC durante seu doutorado no nosso grupo de pesquisa,mostrando que ambas as proteínas são diméricas por diferentes técnicas. Além disso, aRenata caracterizou a cinética da oxidação dessas 1-Cys Prx por diferenteshidroperóxidos. Contudo, para uma compreensão mais completa dos mecanismos de açãodessas enzimas, é necessária a elucidação da estrutura terciária em resolução atômica e aidentificação de redutores biológicos.Assim, o objetivo deste projeto é a caracterização estrutural e bioquímica das enzimasantioxidantes AfPrx1 e AfPrxC do patógeno humano Aspergillus fumigatus. Nessesentido, estamos investigando a redução do ácido sulfênico (Cys-SOH) dessas 1-Cys Prxpor ascorbato, utilizando o método de competição por DCPIP (2,6-diclorofenolindofenol). Resultados preliminares indicaram que AfPrx1 é reduzida porascorbato a pH 7,4, apresentando constante de segunda ordem de of 4.9 x 102 M-1.s-1. Emparalelo, serão realizados ensaios de cristalização de AfPrx1 e AfPrxC, cujos protocolosde expressão e purificação estão bem estabelecidos e geram proteínas recombinantes comalto rendimento e solubilidade. Eventualmente, pretendemos obter estruturas de AfPrx1e AfPrxC complexadas a ascorbato (ou eritroascorbato) por "soaking" ou cocristalização.Em uma fase posterior do projeto, pretendemos analisar os níveis de peróxidos ederivados de D-eritroascorbato (análogo de 5 carbonos de ascorbato) em linhagens de A.fumigatus, cujos genes para AfPrx1 e AfPrxC foram interrompidos. Os níveis de H2O2poderão ser analisados em tempo real e de forma não invasiva em A. fumigatus emutilizando sondas geneticamente codificadas direcionadas para diferentescompartimentos celulares como citosol e mitocôndria. Linhagens de A. fumigatusdeficientes na síntese de eritroascorbato também poderão ser geradas. Como processosredox estão envolvidos na interação de A. fumigatus com hospedeiros, as informaçõesgeradas nesse projeto podem contribuir para a compreensão de mecanismos de virulênciadesse fungo patogênico.