Avaliação bioquímica do estado redox na formação e na estabilidade dos complexos supramoleculares da HSPA5 (BiP)

Resumo

As HSP70s representam uma família crucial de Chaperonas Moleculares desempenhando papeis vitais na homeostase proteica celular. Dentro dessa família, destaca-se a HSPA5, também conhecida como BiP (do inglês Binding immunoglobulin Protein), a forma mais abundantemente expressa das Hsp70 e única encontrada no lúmen do retículo endoplasmático (RE) em eucariotos. Além do RE, a HSPA5 pode ser encontrada nas mitocôndrias, no citoplasma, no nucleoplasma, na superfície celular e exossomos. Do ponto de vista estrutural, essa chaperona é constituída por dois domínios conectados por um linker hidrofóbico: o domínio de ligação a nucleotídeos (NBD) e o domínio de ligação a proteínas-cliente (SBD). Embora predominantemente monomérica, a HSPA5 também se apresenta como oligômeros e complexos supramoleculares (CSM), processo associado à interação via pontes dissulfeto intermoleculares, envolvendo cisteínas no NBD (Cys41) e no SBD (Cys420). Resultados preliminares do grupo de Bioquímica e Biofísica de Proteínas (IQSC/USP) indicam que, na presença de um ambiente redutor, a HSPA5 monomérica catalisa a desmontagem dos CSM formados. Em contraste, em um ambiente oxidante, a forma monomérica aparentemente conduz à degradação desses complexos. Variações redox no RE são conhecidas e, portanto, essas mudanças podem modular a função da HSPA5 in vivo. O propósito deste projeto é compreender como o ambiente redox modula os CSMs da HSPA5 via pontes dissulfeto intermoleculares e como isso pode ativar ou aprimorar a sua aparente ação autoproteolítica. Para alcançar esse objetivo, a HSPA5 humana recombinante será expressa, purificada e submetida a aquecimento para a formação dos CSM. Esses serão repurificados para obter a fração oligomerizada, livre da fração monomérica. Os CSMs serão analisados frente às condições redox variáveis em relação à sua estrutura secundária, terciária e quaternária, utilizando técnicas espectroscópicas (dicroísmo circular e fluorescência) e hidrodinâmicas (cromatografia de exclusão por tamanho, espalhamento dinâmico de luz e métodos eletroforéticos). A funcionalidade será avaliada por ensaios de atividade ATPásica. A ação da fração monomérica nos complexos será analisada cronologicamente por cromatografia de exclusão por tamanho analítica sob condições redox variáveis. Este estudo aprofundado visa elucidar a auto-modulação da HSPA5 por meio de variações redox, potencialmente revelando o mecanismo catalítico subjacente à auto-depuração.