Treinamento em técnicas de cultivo celular e biologia molecular

Resumo

De posse de dados preliminares, e de todo o conjunto de evidências produzido por nosso grupo, o presente projeto propõe investigar a seguinte hipótese: melanopsina (OPN4) e/ou canais de potencial receptor transitório (TRP), expressos nos cardiomiócitos, monitoram entre outros possíveis sinais, a variação da temperatura interna e/ou do estado metabólico local. Sugerimos que provavelmente ocorra uma variação na temperatura no fluxo de sangue oxigenado que entra no coração recém-vindo do trato respiratório e do fluxo de sangue vindo da periferia, com menor pressão e pobre em oxigênio, além da variação circadiana da temperatura interna. Essa variação na temperatura, ou no estado metabólico induzido por essa variação térmica, seria interpretada pelo coração, por ex., na expressão de seus principais hormônios peptídeos natriuréticos (NPs) entre outras possibilidades, para regular relógios locais e o metabolismo e relógios de tecidos e órgãos alvo como tecido adiposo branco (TABTAB) e marrom (TAM), e do próprio coração. Uma vez que se propõe um elo (via liberação de NPs) entre função cardíaca e metabolismo, e entre disfunções metabólicas e ruptura de relógio (Tabelas 1, 2 e 3), poderíamos especular que o desequilíbrio exacerbado dessa via seria o responsável por patologias não só no próprio coração, mas também no organismo como um todo. Ademais, entender como essa circuitaria está alterada em extremos metabólicos como a obesidade e a caquexia abrirá a possibilidade de intervenção no quadro patológico ou ainda na prevenção ou mitigação das possíveis alterações. Avaliaremos como está a recepção de temperatura, ou do estado metabólico, o relógio local e os processos canônicos tecido-específicos in vivo e em explante ou cultura celular de núcleo supraquiasmático (NSQ), médio basal, coração, TAB e TAM de camundongos WT e KO para adrenoceptor ²1, Opn4, TrpV1, TrpM8 e TrpA1 em condições fisiológicas e nos extremos metabólicos de obesidade e decaquexia, associados a ensaios de variação de temperatura. Ao fazermos inicialmente transcriptoma dos órgãos em questão em camundongos WT submetidos a 22oC (desafio por estímulo de frio) e a 30oC (termo-neutralidade), teremos um norte para focarmos as investigações nas vias e sinalizações de recepção alteradas pelo desafio de temperatura. Os ensaios in vivo serão executados a 22 (ou 8oC abaixo da termoneutralidade em genótipos alterados, desafio por estímulo de frio) e 30oC (ou outra temperatura de termoneutralidade determinada nos genótipos alterados) e os in vitro a 34 e 37oC para animais WT (ou em outra gama a ser determinada para os genótipos alterados); parte dos ensaios serão realizados na presença de agonistas e antagonistas de OPN4 e canais TRP, ou em células nocauteadas por CRISPER. Nos experimentos in vivo, realizaremos ensaios de telemetria de atividade locomotora e temperatura interna, calorimetria e perda de calor. Analisaremos os genes de relógio e genes tecido-específicos identificados pelo transcriptoma comparativo usando a princípio as seguintes metodologias: imunocitoquímica, PCR quantitativo, Western blot, citometria de fluxo com imagem, CRISPER. Ao longo do projeto pretende-se estabelecer a linhagem de camundongos nocautes para Opn4 órgão-específico por sistema Cre-lox.