Investigação do possível papel dos pirofosfatos de inositol em vias de reparo de DNA em Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas

Resumo

Pirofosfatos de inositol (PP-IPs) - principalmente os chamados IP7 e IP8 - estão envolvidos em uma ampla gama de processos celulares em eucariotos, como por exemplo apoptose, dinâmica do ciclo celular, regulação do comprimento dos telômeros, recombinação homóloga, entre outros. No entanto, o mecanismo preciso de ação dos PP-IPs em vias relacionadas ao metabolismo do DNA não é totalmente compreendido. IP7 e IP8 são sintetizados por vias envolvendo a participação das quinases IP6K e PP-IP5K, respectivamente. Tripanossomatídeos possuem um gene ortólogo para IP6K, mas aparentemente não possuem ortólogos para PP-IP5K, o que os torna excelentes modelos para o estudo de PP-IPs. Trypanosoma cruzi (família Trypanosomatidae) é um parasita eucariótico unicelular e agente etiológico da doença de Chagas, uma doença tropical negligenciada que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. Deste modo, a principal meta deste projeto é investigar o possível papel dos PP-IPs nas principais vias de reparo do DNA (reparo por recombinação homóloga - HR, reparo por excisão de bases - BER e reparo por excisão de nucleotídeos - NER) utilizando T. cruzi como modelo experimental e objetivando identificar vias fundamentais que possam ser usados para intervenções espécie-específica. Para isso, linhagens de T. cruzi (CL Brener) knockout para IP6K (perda de função) e superexpressando IP6K (ganho de função) serão geradas usando a abordagem CRISPR-Cas9. Após a confirmação da diminuição ou aumento de IP7 nas linhagens correspondentes, elas serão desafiadas com diferentes agentes genotóxicos (radiação ionizante, peróxido de hidrogênio e luz ultravioleta) e a capacidade de reparo do DNA será avaliada por métodos clássicos (microscopia de fluorescência, western blot usando anticorpos contra proteínas envolvidas no reparo de DNA, cometa, TUNEL, citometria de fluxo, curvas de crescimento, etc.) e abordagens inovadoras. Por exemplo, pretendemos adaptar e aplicar um método baseado em transfecção para avaliar se as linhagens de T. cruzi serão capazes de reparar danos localizados em um DNA exógeno (plasmídeo). Além disso, usando uma abordagem ousada, as moléculas de IP7 serão sintetizadas in vitro com a porção ²-fosfato marcada. Essas moléculas serão utilizadas em reações de pirofosforilação com o objetivo de rastrear seus alvos principais por pull-down e espectrometria de massas. Após a identificação desses alvos, estudos in vivo e in silico aprofundados serão realizados para investigar o papel da pirofosforilação nessas proteínas. Em resumo, este projeto contribuirá significativamente para um melhor entendimento da pirofosforilação durante o reparo do DNA, uma modificação pós-traducional não-enzimática ainda pouco compreendida. (AU)