Construção de linhagens de Drosophila melanogaster knockout para Ldh e Gpo1 através da técnica de CRISPR

Resumo

A utilização da mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster, como organismo-modelo tem sido cada vez mais visada pela comunidade científica. Drosófilas possuem um rápido ciclo de vida, viabilizando a obtenção de diferentes gerações em um curto período de tempo. Em nosso laboratório, temos estudado a enzima oxidase alternativa AOX e a maneira como sua expressão em drosófilas altera seu metabolismo durante o desenvolvimento. Dados ainda não publicados do nosso laboratório sugerem a influência da expressão de AOX em dois sistemas redox muito importantes para o desenvolvimento larval: lactato desidrogenase (Ldh) e a lançadeira de glicerol-3-fosfato. Por meio da fermentação lática, a Ldh utiliza o produto da ação da glicólise, o piruvato, para formar lactato e NAD+. A lançadeira de glicerol-3-fosfato, por sua vez, possui um componente citosólico, a enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase citosólica, que transforma dihidroxiacetona em glicerol-3-fosfato, também oxidando NADH em NAD+. O componente mitocondrial, a enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase mitocondrial, transforma glicerol-3-fosfato em dihidroxiacetona, enviando os elétrons diretamente para a cadeia respiratória. Ambos sistemas, portanto, contribuem para o equilíbrio redox do organismo, permitindo que a glicólise continue funcionando pela regeneração do NAD+. O metabolismo glicolítico é importante durante o acúmulo de biomassa larval, e também durante o crescimento de tumores. Estudos demonstraram que tanto células tumorais quanto larvas de drosófila que possuem uma inativação da Ldh apresentam uma compensação com maior atuação da lançadeira de glicerol-3-fosfato. Desse modo, construir linhagens de drosófilas geneticamente editadas para os genes codificadores de Ldh e da lançadeira de glicerol-3-fosfato constitui um meio interessante para compreender mais a fundo as interações genéticas e metabólicas dessas enzimas com AOX. Em D.melanogaster, grande parte do desafio de se construir linhagens transgênicas, visando a criação de mutantes nulos, é o fato destas mutações não necessariamente possuírem nenhum fenótipo de fácil identificação, o que dificulta a visualização do sucesso da técnica empregada no genoma do indivíduo. Desse modo, a técnica de co-CRISPR permite que mais de um evento mutacional seja feito no organismo - no gene de interesse e em um gene marcador fenotípico de fácil identificação. Dessa forma, empregaremos o método desenvolvido por Kane e colaboradores (2017) para construir linhagens deletérias para genes codificadores da Ldh e da lançadeira de glicerol-3-fosfato com o gene marcador ebony, que gera uma mudança dominante na coloração do corpo do adulto. Nesse sentido, o objetivo principal do trabalho é a construção de linhagens de drosófilas que sejam knockout para os genes Ldh (que codifica a Ldh) e Gpo1 (que codifica a principal isoforma da glicerol-3-fosfato desidrogenase mitocondrial) por meio da técnica de CRISPR. Em específico, será feita a clonagem dos gRNAs (fragmentos de RNA que direcionam a enzima Cas9 para a porção do DNA de interesse a ser clivada) para os alvos pretendidos no vetor pCFD3:U6:3-gRNA - para o desenho dos alvos de Ldh e Gpo1 utilizaremos a plataforma FlyCrispr. Após a construção dos vetores plasmidiais, embriões da linhagem y[1] M{w[+mC]=nos-Cas9.P}ZH-2A (BDSC 54591 - que expressa constitutivamente a proteína Cas9 na linhagem de células germinativas) serão microinjetados. A prole dessa linhagem, que deverá apresentar de fato a deleção dos genes de interesse em seu genoma, será caracterizada genetica e funcionalmente. Por fim, para comprovar o sucesso da técnica, será feito o sequenciamento dos animais.