Bolsa 23/08580-8 - Bioluminescência, Bioprocessos - BV FAPESP
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LuciSTARÇ Sistema de Bioluminescência para Ambientes Químicos Complexos

Processo: 23/08580-8
Modalidade de apoio:Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2023
Data de Término da vigência: 31 de março de 2024
Área de conhecimento:Interdisciplinar
Acordo de Cooperação: SEBRAE-SP
Pesquisador responsável:Mona das Neves Oliveira
Beneficiário:Christiane Ribeiro Janner Herrera
CNAE: Pesquisa e desenvolvimento experimental em ciências físicas e naturais
Vinculado ao auxílio:22/13678-4 - LuciSTARÇ sistema de bioluminescência para Ambientes químicos Complexos, AP.PIPE
Assunto(s):Bioluminescência   Bioprocessos   Engenharia de proteínas   Luciferases   Biologia sintética
Palavra(s)-Chave do Pesquisador:bioluminescência | bioprocessos | engenharia de proteínas | luciferase | Biologia Sintetica

Resumo

O escopo deste trabalho é a validação técnica de uma formulação enzimática que estabilize a LuciStar, enzima desenvolvida pela BIOLINKER em produtos da Linha AMBEV. A proposta da Biolinker consiste em submeter uma luciferase à evolução dirigida a fim de que essa seja funcional sob as seguintescondições: pH 2,5-4,5; temperatura 3-5 °C; presença de 4-8 % de álcool. Essas condições se aproximam dos ambientes encontrados na linha de produtos alvo. A proposta é justificável tanto do ponto de vista comercial-financeiro como científico. O primeiro se é devido ao impacto que a luminescência pode conferir ao produto, destacando marcas que aplicam tal tecnologia, o segundo é devido a inexistência de enzimas luminescentes que mantenham a atividade nessas condições. A Biolinker, desenvolvedora do produto atual, através de programa de aceleração com AMBEV encontrou essa demanda do parceiro que busca cocriar produtos com novas experiências para o usuário. Do ponto de vista científico esse projeto visa o aperfeiçoamento de proteínas para que haja a atividade de interesse em ambientes químicos complexos condizentes com a realidade da linha alimentícia, bem como geraria uma luciferase mais estável que poderia ser usada em pesquisas e diagnósticos sob as condições descritas onde a enzima selvagem é pouco ativa.Essa proposta se trata da continuidade de um projeto previamente financiado pela Ambev. Executamos no primeiro momento uma validação técnica com as enzimas do nosso portfólio, identificando quais seriam os melhores candidatos para a proposta de uso e verificamos a viabilidade e limitações de usos. As luciferases utilizam diferentes substratos e dão origem a luz com cores distintas. Foi feita uma triagemdas diferentes luciferases e como a atratibilidade é fator chave nesse projeto, foi escolhida aquela que deu origem à luz de cor e intensidade mais interessante do ponto de vista comercial em lisado celulartamponado. Nesse caso foi a luciferase ngluz do fungo brasileiro Neonotophanus gardneri (N. gardneri)que produziu uma luz intensa de coloração verde.Tendo determinado a luciferase alvo, foi desenvolvido um protocolo de expressão e purificação em S. cerevisae. Até onde sabemos fomos os primeiros a alcançar isso. Foi possível obter um grau de purezade aproximadamente 65 % com um passo de purificação por cromatografia de interação hidrofóbica. Trabalhos anteriores aos nossos foram feitos a partir de lisado celular ou de extrato natural de N.gardneri. No entanto, com esse protocolo obtivemos somente 1 mg de ngLuz por litro de meio de cultura. Esse rendimento está muito abaixo do esperado. Calculamos o preço de produção, que incluireagentes, meios de cultura e salário de pesquisadores, em R$ 5.000,00 por mg de proteína produzida. A presente proposta visa realizar uma validação técnica mais robusta, estudando um protocolo mais eficiente de expressão e purificação em E. coli que diminua os custos de produção para aproximadamente R$ 200 por mg de proteína. Para avançarmos com o projeto é de extrema importância que o sistema de bioluminescência não encareça demasiadamente o produto final.Usando ngLuz purificada foram feitos ensaios de atividade enzimática da luciferase por avaliação visualde emissão de luz. Resultados prévios da atividade enzimática foram conduzidos em diferentes ambientes. A mais eficiente catálise foi observada no produto 2 enquanto em outros ambientes a reação de emissão de luz foi extremamente baixa. Por exemplo, no produto 4 a enzima praticamentenão demonstrou nenhuma atividade. Para uma análise mais robusta dos dados foi feita a comparação de luminescência utilizando leitor de placas e comparamos a luminescência da proteína em meio tamponado com pH neutro (a geração de luz ficou na casa de 30000000 RLU), enquanto que a mesma concentração de enzima e substrato no produto 2 de maior luminescência foi de apenas 400000 RLU, ou seja 100 vezes menor.

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