Obtenção de mutantes de proteínas Leucine Rich Repeats (LRR) em Leptospira interrogans e avaliação fenotípica das interações patógeno-hospedeiro

Resumo

Leptospirose é uma zoonose de importância mundial e considerada uma doença tropical negligenciada. A doença é causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira e afeta diversos mamíferos, incluindo o homem como hospedeiro acidental e terminal. Até o presente momento não existe uma vacina eficaz contra a doença, a qual possui grande importância socioeconômica principalmente nos países tropicais em desenvolvimento, e estimativas feita pela OMS ocorrem anualmente cerca de 873.000 casos graves e 49.000 mortes de pessoas por leptospirose, em todo o mundo. O combate à leptospirose torna-se mais dificultado com a falta de saneamento básico em regiões de extrema pobreza, aumento de casos de enchentes e com a falta de esclarecimento da biologia do patógeno. Diversos grupos de pesquisa buscam entender melhor os mecanismos de patogenicidade e desenvolvimento de uma vacina eficaz avaliando potenciais candidatos, que em geral são proteínas de membrana externa conservadas em diferentes espécies de leptospiras patogênicas. Uma classe de proteínas de interesse são as aquelas contendo domínio LRRs (Leucine Rich Repeats) que normalmente são proteínas de membrana ou secretadas, estando em contato direto com componentes do hospedeiro; o papel de proteínas LRR na patogênese da leptospirose ainda é pouco explorado. A caracterização é feita geralmente por meio da expressão e purificação de proteínas recombinantes, que muitas vezes podem não espelhar o que ocorre in vivo. Deste modo, desenvolver linhagens mutantes tem sido uma abordagem interessante. Neste sentido, o presente projeto focará na elucidação do papel de 2 proteínas LRR de L. interrogans, por meio de ensaios in vitro com as respectivas proteínas recombinantes, e validação dos achados pela construção de linhagens recombinantes de L. biflexa (saprofítica) expressando estas proteínas, visando um ganho de fenótipo por meio da validação funcional destas como possíveis ligantes a componentes do hospedeiro. Em seguida, utilizando técnicas de mutagênese por CRISPR-interferência desenvolvidas por nosso grupo, serão obtidos mutantes knockdown das proteínas de interesse para estudos de perda de fenótipo na estirpe patogênica L. interrogans. A virulência dos mutantes será também avaliada em modelo animal. O conjunto dos resultados obtidos com o presente Projeto de Pesquisa contribuirão para um melhor entendimento das interações patógeno-hospedeiro e mecanismos de virulência das leptospiras. (AU)