Caracterização das isoformas específicas dos transcritos RMEL3 e validação do RMEL3 como alvo terapêutico

Resumo

RNAs longos não codificantes (lncRNAs) constituem uma grande e diversificada classe de RNAs funcionais. Identificamos o lncRNA RMEL3 como um transcrito enriquecido em melanoma, particularmente naqueles portadores da mutação BRAFV600E e com fenótipo marcantemente invasivo. Os dados indicam que o RMEL3 funciona como um regulador positivo das vias de MAPK e PI3K e negativo de proteínas inibitórias do ciclo celular, estimulando o crescimento do melanoma e protegendo células não transformadas da parada de proliferação e da morte celular causadas por privação de fatores de crescimento e mitógenos. Com o objetivo de caracterizar seu mecanismo de ação, analisamos a interação do transcrito endógeno com proteínas. Dentre as candidatas identificadas, estão proteínas envolvidas diretamente na via MAPK (ARAF, FAM83D) e na via supressora de tumor de Hippo (STK3/Mst2), entre outras, envolvidas no reparo do DNA, regulação transcricional, apoptose, citoesqueleto, tradução de mRNA e metabolismo energético. Combinações de dados de ChIP-seq e RNAseq de uma grande variedade de tecidos revelam numerosos elementos regulatórios próximos e ao longo do gene e sugerem uma alta complexidade de isoformas de transcritos. Análise desses dados consolida a noção de que a isoforma canônica (RMEL3_201) é altamente restrita a melanoma, mas a isoforma alternativa RMEL3_202 e, possivelmente, variadas outras isoformas minoritárias sejam expressas em diversos tecidos, tais como, gônadas, células embrionárias, endoteliais, adiposas e neurais. As duas isoformas anotadas e uma circular (hsa_circ_0142225) são expressas em melanoma e respondem de modo diverso ao tratamento com um inibidor de BRAFV600E. Portanto, dando continuidade a estudos prévios do nosso laboratório, propomos os seguintes objetivos para este projeto: i) identificar e caracterizar funcionalmente os transcritos completos do gene RMEL3 expressos em diferentes contextos fisiológicos, patológicos e farmacológicos e investigar os mecanismos repressivos e ativadores responsáveis pelo padrão específico de expressão de cada isoforma; ii) validar as interações do transcrito RMEL3 com as proteínas candidatas identificadas previamente e analisar seu impacto nas vias de sinalização de MAPK, PI3K e Hippo em melanoma; iii) interferir na expressão de isoformas do gene RMEL3 e realizar análises fenotípicas e de complementação funcional, in vitro e in vivo. Com este estudo, buscamos contribuir para uma anotação acurada do gene RMEL3 e elucidação dos mecanismos pelos quais as principais isoformas de transcritos exercem suas atividades funcionais.