Estudos de biotransformação e ensaios comportamentais de novas substâncias psicoativas através de modelos in vivo empregando o Zebrafish (Danio rerio)

Resumo

Atualmente, as Novas Substâncias Psicoativas (NPS) vêm ganhando destaque dentre as substâncias utilizadas para uso recreacional. A emergência das NPS traz um desafio à toxicologia, uma vez que a demanda de identificação de tais substâncias é cada vez maior. Em estudos toxicológicos, os ensaios utilizando o peixe zebrafish (Danio rerio) vêm se destacando, por diversas vantagens frente a outros modelos in vivo. Estudos de toxicidade aguda, biotransformação e comportamento observando respostas específicas, de acordo padrão de posição no aquário, movimentação dos peixes e agressividade, podem ser conduzidos. Assim, visa-se estudar a toxicidade aguda, a biotransformação e os efeitos sob o comportamento de canabinoides sintéticos, catinonas sintéticas, derivados de cetamina e novos benzodiazepínicos, empregando experimentos in vivo com o zebrafish. O projeto seguirá as recomendações da OECD 236 e do manual de criação de zebrafish em biotério para a obtenção, manutenção e utilização dos animais. Para determinação da toxicidade das NPS em estágios de desenvolvimento embrionário, será realizado o teste de toxicidade em embriões, consistindo na exposição precoce do embrião à substância. Durante tal período, até quatro alterações apicais são registradas como indicadores de toxicidade. Também será realizado o teste de toxicidade em estágio larval, com o objetivo de determinar a concentração máxima tolerada para ser utilizada nos estudos de metabolismo e comportamentais. Para os estudos de metabolismo em estágio larval, serão colocadas dez larvas 4 dpf por poço, com ensaios em triplicatas. As larvas serão eutanasiadas em água gelada e, tanto estas quanto o meio em que estão, serão submetidos a método de extração e de análise por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS) e cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas de alta resolução e exatidão de massas (LC-HRMS). Já para o estudo de metabolismo em estágio adulto, será seguido o procedimento zebrafish water tank metabolism (ZWT), com a adição da solução contendo a substância de interesse ao tanque. As amostras serão submetidas a método de extração e de análise por LC-MS/MS e LC-HRMS. Por fim, serão conduzidos os ensaios comportamentais com o estágio larval (tigmotaxia, teste de nado e teste claro-escuro) e com o estágio adulto (teste claro-escuro, teste do espelho, campo aberto, teste do aquário novo e preferência social). Grupos controle (sem exposição à substância) serão utilizados para fins de comparação, os grupos de exposição serão expostos à cada substância de interesse por 20 minutos e submetidos aos procedimentos. Todos os testes comportamentais em estágio larval serão realizados em triplicata e os testes em adultos usarão 12 animais por substância de exposição em cada. Por meio do teste de toxicidade aguda em embriões, espera-se determinar o nível de toxicidade das NPS testadas nos estágios de desenvolvimento embrionário do zebrafish, bem como a determinação da LC50 para as mesmas. Por sua vez, com o teste de toxicidade aguda em estágio larval, espera-se definir a dose teste de trabalho, sendo ela a maior concentração testada em que não ocorram sinais de toxicidade como sedação e comprometimento locomotor agudo. Com os ensaios de biotransformação em estágio larval e adulto, espera-se identificar, pela técnica de LC-MS/MS e LC-HRMS, os possíveis produtos de biotransformação formados a partir da exposição do zebrafish às NPS em estudo. Para isto, busca-se desenvolver, otimizar e validar uma metodologia analítica para as substâncias em questão e seus produtos de biotransformação. Por fim, com os estudos comportamentais realizados com o zebrafish em estágio larval e adulto, busca-se identificar o padrão comportamental agudo frente à exposição à tais NPS, de acordo com local de preferência no ambiente aquático, padrão de posição no aquário, movimentação dos peixes e agressividade. (AU)