Identificação de novas enzimas com capacidade de agregação em condições de privação de nutrientes e o papel do mesmo na progressão tumoral.

Resumo

citoplasmáticos, como transdução de sinal e metabolismo de RNA. Atualmente acredita-se que o processo de formação de compartimentos não membranosos possa desempenhar também um papel crítico na regulação de redes metabólicas. Diversos estudos têm identificado enzimas metabólicas que são capazes de formar condensados biomoleculares e/ou filamentosos; entretanto, as conexões entre essas estruturas e a regulação da atividade enzimática são conhecidos apenas para um número limitado de casos. Um trabalho recente identificou 60 enzimas metabólicas de levedura capazes de formar estruturas, foco ou filamento (detectadas por microscopia de fluorescência), em determinadas condições de crescimento e estados metabólicos. O estudo mostrou que a associação frequentemente aconteceu em enzimas metabólicas de pontos de conexão de uma dada via principal com seus braços metabólicos. Desta maneira, se especula que os agregados possam ser importantes para, em tempos de crescimento ou estresse, promover ou inativar a atividade de uma dada enzima e, desta maneira, garantir o fluxo metabólico para diferentes destinos. Várias das enzimas detectadas em levedura como sendo capazes de alterar o perfil de fluorescência de difuso para agregado (foco ou filamento), em função de alterações no estado metabólico, são conservadas em mamíferos. Para poucas delas o mesmo fenômeno já foi mostrado em células de mamíferos, e ainda menor é o número de enzimas para as quais a estrutura nestes estados agregados foi definida por microscopia eletrônica. Neste sentido, neste projeto, vamos avaliar 14 enzimas metabólicas de mamíferos (via glicolítica, via de biossíntese de purina, via de metabolismo de glutamina e de metabolização de metionina/homocisteína) homólogas das de leveduras, quanto a sua capacidade de agregar, in situ, em resposta a alterações nas condições de cultivo. As enzimas serão expressas ectopicamente em fusão com a proteína fluorescente mKO2 e vamos manipular o meio de cultura de maneira a remover glutamina mantendo os outros aminoácidos (+aa -Gln), glutamina e todos os outros (-aa -Gln), todos aminoácidos mantendo glutamina (-aa + Gln) e glicose, os principais nutrientes envolvidos nas vias descritas. As enzimas que mostrarem alterar o padrão de agregação em célula em função da manipulação de nutrientes serão clonadas em vetores de expressão em E. coli, expressas e purificadas in vitro. Seu estado de oligomerização será avaliado em função da adição de moléculas que potencialmente podem alterar seu estado como substratos, produtos e cofatores. Pelo menos 1 das enzimas que mostrarem capacidade de oligomerização in vitro e para as quais encontramos as condições para tal serão avaliadas por microscopia eletrônica com negative satinning e crio-microscopia. Os estudos com enzimas selecionadas serão executados em2colaboração com Prof. Andre Ambrósio (Instituto de Física, USP - São Carlos). Para esta enzima, caso tenhamos a informação necessária para entendimento dos mecanismos moleculares de polimerização, vamos usar técnicas de implantes singênicos em camundongos imunocompetentes, seguido de análise do perfil de infiltrados imunes e metabólitos. Células tumorais serão modificadas de maneira modificar a polimerização (formação constitutiva ou quebra) pela introdução de mutações no gene da enzima. Estas células também serão estudadas in vitro para verificar o impacto da polimerização da enzima no consumo de oxigênio e secreção de lactato (acidificação celular).