Geração de construtos de segunda e terceira geração de 2DA6-CAR e expressão em células NK-92 visando o controle da infecção por Paracoccidioides brasiliensis

Resumo

A paracoccidioidomicose (PMC), causada principalmente pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis, é uma micose granulomatosa sistêmica de maior prevalência na América do Sul com alta correlação com indivíduos tendo atividades rurais. A PMC causou cerca de 51% das mortes causadas por micoses sistêmicas no Brasil, entre os anos de 1996 e 2006, segundo dados do Ministério da Saúde. A infecção ocorre pela inalação de conídios presentes no solo, que atingem o tecido pulmonar do hospedeiro, e as manifestações clínicas se dividem em forma aguda/subaguda com os pacientes tendo febre alta, linfonodomegalia generalizada ou intra-abdominal e lesões cutâneas; na forma crônica há um alto acometimento do tecido pulmonar, lesões cutâneas na mucosa oral e nasal. O tratamento convencional, baseado em derivados azólicos e anfotericina B, é utilizado por um período de até 24 meses, no entanto, há uma busca constante em abordagens imunoterapêuticas para reduzir os efeitos colaterais adversos causados pelos antifúngicos disponíveis para a clínica. Nesse sentido, estratégias de vacinação e a transferência adotiva de células da imunidade tem sido investigada no tratamento da PCM e com um efeito promissor na imunoterapia contra a PCM. Com isso, nosso grupo de pesquisa tem avançado na bioengenharia de células T e NK para expressar receptores antigênicos quiméricos (CAR) que redirecionam as células modificadas a reconhecerem o fungo alvo. Os receptores CAR ao redirecionar as células a interagirem com as formas fúngicas em estudo medeiam a ativação celular, através do domínio de transdução de sinal, com a liberação de componentes citotóxicos que atuam no controle do crescimento fúngico. Recentemente, nosso grupo construiu um CAR, denominado 2DA6-CAR, com especificidade para mannana contendo backbone de ±-1,6-mannose, e os dados preliminares demonstram a capacidade de 2DA6-CAR em reconhecer P. brasiliensis. Com isso, a atual proposta busca avaliar o efeito de diferentes variantes de 2DA6-CAR, através da construção de CAR de segunda e terceira geração, com modificação no domínio de ativação intracelular via as moléculas co-estimulatórias CD28, CD137 e ICOS. Os diferentes construtos de 2DA6-CAR serão expressos por células Jurkat para avaliar os seguintes objetivos específicos: (i) avaliar a expressão de 2DA6-CAR na superfície celular através de citometria de fluxo; (ii) determinar o peso molecular dos diferentes constructos de 2DA6-CAR através de western blot; (iii) analisar a capacidade dos diferentes construtos de 2DA6-CAR expressos em induzir a ativação celular, através da mensuração dos níveis de IL-2, na presença da forma leveduriforme de P. brasiliensis. Em seguida, o construto de 2DA6-CAR com maior funcionalidade será expresso em células NK-92 e os seguintes objetivos serão considerados: (i) ativação de células NK-92 expressando 2DA6-CAR na presença de P. brasiliensis, através da dosagem de INF-³ por ELISA e mensuração de grânulos citotóxicos por citometria de fluxo; (ii) avaliar o efeito fungicida e fungistático de células NK-92 expressando 2DA6-CAR sobre P. brasiliensis através da quantificação da carga fúngica por CFU.