Interações do dimetanossulfonato de etano (EDS) com as linhagens de células de leydig R2C, MA-10 e MLTC-1: uma abordagem in vitro para entender o mecanismo molecular da ação do EDS

Resumo

Dimetanossulfonato de etano (EDS) é uma molécula com conhecida citotoxicidade seletiva em células de Leydig adultas após gavagem, injeções intraperitoneais e intratesticulares, o que leva à privação androgênica masculina e infertilidade. Após a exposição ao EDS em ratos machos adultos, as células Leydig adultas repovoam os testículos a partir do pool de células de Leydig tronco e começam a produzir hormônios androgênicos novamente. Estudos in vitro com linhagens celulares de Leydig imortalizadas, derivadas de ratos e camundongos, mostraram efeitos semelhantes de morte celular promovida pelo EDS, e indicam que inicialmente a esteroidogênese comprometida antes do processo de apoptose. Assim, este estudo visa investigar, por meio de métodos in vitro e análises moleculares, os mecanismos exercidos pelo EDS em diferentes linhagens celulares de Leydig (células R2C, derivadas de rato; MA-10 e MLTC-1, derivadas de camundongo), e as implicações dessa interação em genes-alvo relacionados ao estresse oxidativo e à função endócrina (hormônios esteroides e INSL3). Para tanto, diferentes linhagens celulares de Leydig serão incubadas por 3 horas (efeitos imediatos) ou 24 horas (efeitos tardios) com veículo (0,5% DMSO) ou duas doses de EDS (para células de camundongos menos sensíveis ao EDS, 10 nM e 20 nM; para células de rato mais sensíveis ao EDS, 2 e 10 nM). As várias linhagens celulares de Leydig serão transfectadas transitoriamente com os plasmídeos promotores (construções promotoras Gsta3, Star, Cyp11a1 ou Insl3) e, em seguida, serão tratadas com EDS ou DMSO (veículo) com ou sem 8Br-cAMP, molécula que estimula a esteroidogênese. No final do período de tratamento, as células serão lisadas, os lisados coletados e as medições de luciferase serão realizadas. Proteínas de ligação ao DNA nestas linhagens de células de Leydig também serão avaliadas por abordagem de precipitação de DNA acoplada à espectrometria de massa, para identificar o(s) fator(es) de transcrição alvo(s) do EDS. Este estudo permitirá uma melhor compreensão dos mecanismos de ação do EDS nas células de Leydig, empregando métodos modernos em biologia reprodutiva e toxicologia, contribuindo para as ciências básicas, bem como aprimorando o conhecimento desta molécula como uma abordagem de controle de fertilidade a ser aplicada em animais sinantrópicos, de criação, de zoológico e de estimação. (AU)