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Geração e validação de biblioteca CRISPR lentiviral para E3 ubiquitina ligases

Processo: 22/13486-8
Modalidade de apoio:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de dezembro de 2022
Vigência (Término): 30 de novembro de 2023
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Humana e Médica
Pesquisador responsável:Fabio Papes
Beneficiário:Gabriella de Oliveira Fortes
Instituição Sede: Instituto de Biologia (IB). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
Assunto(s):Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas
Palavra(s)-Chave do Pesquisador:Crispr | E3 Ubiquitina ligases | Pths | Tcf4 | Neurobiologia molecular

Resumo

O Fator de Transcrição 4 (TCF4) é uma proteína pertencente à família bHLH amplamente expressa em diversos tecidos durante o desenvolvimento. A função do TCF4 no sistema nervoso está relacionada com a proliferação e diferenciação de células progenitoras neurais (NPCs), e por isso, mutações no gene TCF4 estão associadas a inúmeros distúrbios neurológicos. A haploinsuficiência do Fator de Transcrição 4 causa a Síndrome de Pitt-Hopkins (PTHS), uma doença genética neurológica rara pertencente ao espectro autista cujas manifestações incluem comportamentos repetitivos e estereotipados, atraso motor, deficit cognitivo, anomalias gastrointestinais e fenótipo facial característico. Apesar do impacto da PTHS na vida dos pacientes e suas famílias, ainda não existem tratamentos específicos. Tendo em vista que a PTHS é causada pela quantidade insuficiente da proteína TCF4 nas células, a compreensão dos mecanismos de degradação do TCF4 torna-se extremamente relevante para o desenvolvimento de novas terapias. O processo de ubiquitinação é uma modificação pós-traducional que ocorre através de uma sequência de reações enzimáticas envolvendo enzimas E1, E2 e E3, que levam à marcação de proteínas para a degradação via proteassomo. As E3 ubiquitina ligases realizam a última etapa do processo, provendo a especificidade da reação por reconhecerem resíduos de lisina em proteínas-alvo e catalisarem a transferência da molécula de ubiquitina. Para encontrar a E3 ligase envolvida no processo de degradação de TCF4, o laboratório realizará um screening de biblioteca CRISPR em vetores lentivirais, contendo sgRNAs para todas as E3 ligases do genoma humano em células progenitoras neurais (NPCs) superexpressando a proteína TCF4 fusionada a um gene repórter. O CRISPR screening é uma técnica baseada na edição gênica em larga escala para a geração de knockout em genes-alvo selecionados, cujo objetivo é a obtenção de uma população heterogênea de células, onde cada célula possui knockout para um gene diferente. O presente projeto de Iniciação Científica tem como objetivo produzir os lentivírus da biblioteca CRISPR para E3 ubiquitina ligases e validar estes vetores, que serão futuramente utilizados em estudos que buscam identificar a enzima envolvida no processo de degradação do Fator de Transcrição 4 via proteassomo.

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