Capacitação em técnicas para cuidado, manutenção e reprodução de linhagens transgênicas de camundongos Cre-LoxP e animais knockouts.

Resumo

Objetivos: Capacitar o bolsista para manutenção de camundongos transgênicos, e de técnicas laboratoriais, como extração de DNA, reação de PCR e eletroforese em gel de agarose. Duas tarefas específicas e complementares serão de responsabilidade do bolsista: (i) capacitação sobre normas de segurança e cuidados na manipulação de animais; (ii) genotipagem dos animais.Plano de trabalho: O bolsista será responsável por manter o biotério nas condições ideais (segundo as normas do comitê de ética) de limpeza, iluminação e umidade, além dos cuidados com os animais: distribuição e limpeza das caixas, manutenção de água e comida, reprodução e sexagem. Será estabelecida uma rotina onde as tarefas acima descritas serão distribuídas durante a semana. Inicialmente o bolsista receberá treinamento e capacitação inicial sobre as normas de biossegurança do laboratório e sobre o uso e manipulação de animais de experimentação.Genotipagem: O bolsista será responsável pelo cruzamento de camundongos knockouts ou transgênicos (formação de casais e troca das caixas), coleta de amostras, extração de DNA, reação de PCR e eletroforese em gel de agarose. Após a realização de todas essas etapas, será possível a identificação do genótipo dos animais. Tarefas como: preparo de soluções, processamento de tecidos coletados para a realização de diversas, além de participar das discussões científicas do laboratório, também farão parte da rotina do bolsista.Metodologia a ser empregada: O screening inicial para identificação do animal se dará por meio da utilização da técnica de PCR, com primers específicos para os alvos. Para isso os animais no momento do desmame serão numerados por cortes nas orelhas, seguindo padrão internacional. Na sequência será retirado um pequeno pedaço da porção distal da cauda para extração de DNA. Os tecidos serão lisados com o acréscimo de 200uL de tampão de lise (pH 8,0) acrescido de proteinase K (Life Technologies), na proporção de 1,5mg/mL de solução (Tampão de Lise: Tris HCl 50 mM pH 8,0; EDTA 10 mM pH 8,0; SDS 0,5%; H2O MiliQ; Proteinase K 1,5 mg/mL). A solução será mantida por 2 horas em banho-maria à 65oC para otimizar a lise celular. Após esse período, adiciona-se 200uL do tampão de lise sem proteinase K, e mantem-se em temperatura ambiente por 15 minutos. Após, as amostras serão centrifugadas (11.000 RPM, 4oC, 20 minutos). Para precipitação do DNA, cerca de 300uL do sobrenadante será transferido para outro tubo contendo 400uL de etanol absoluto e 20uL de acetato de sódio 3M. As amostras serão novamente centrifugadas (6.000 RPM, 4oC, 10 minutos), o sobrenadante descartado e o precipitado lavado com etanol 70%. Após lavagem e nova centrifugação, o pellet será diluído com 200uL de TE pH 7,5 (Tris HCl 10 mM e EDTA 1mM). A solubilização do DNA será realizada em banho maria a 65oC, por 30 minutos, e sua quantificação 260/280 nm será realizada no aparelho NanoDrop, Life Technologies, utilizando diluição de 1:20 em TE. Será feito um gel de agarose e as bandas detectadas de acordo com o peso molecular dos alvos. As linhagens de animais knockouts ou transgênicos que serão mantidas são: CX3cr1-Cre, CSFR1-Cre, TRPV1 KO, TLR4KO, iNOS KO. Além da manutenção de cada linhagem, os animais deverão ser cruzados entre si para a obtenção dos animais de interesse.