Análise da expressão gênica unicelular de tecidos linfoides humanos infectados por vírus respiratórios pandêmicos: SARS-CoV-2 e Influenza

Resumo

A hipertrofia de adenoides e amígdalas palatinas é uma condição inflamatória crônica de alta prevalência, de etiologia desconhecida, com forte impacto na saúde das crianças, geralmente levando à cirurgia. Como sentinelas das vias aéreas superiores, as amígdalas desempenham papéis importantes na resposta imune a Vírus Respiratórios (VRs), que são as causas mais frequentes de Infecções Respiratória Aguda (IRA). Em estudos prévios, nós relatamos uma frequência muito alta (97%) de VRs em amígdalas hipertróficas com inflamação crônica e secreções respiratórias de crianças sem sintomas de IRA, durante todo o ano, sem aparente sazonalidade. Curiosamente, a citometria de fluxo e a imuno-histoquímica revelaram que as células linfomononucleares (LMNCs) podem abrigar várias espécies e tipos de VRs. Juntos, esses dados indicam que há infecção assintomática de longo prazo, por vírus respiratórios nas LMNCs. Para infectar as LMNCs em amígdalas inflamadas cronicamente, os vírus devem estabelecer complexas interações patógeno-hospedeiro para contornar as respostas imunes e antivirais. Dada a multiplicidade de fatores que podem afetar o estabelecimento e a manutenção dessas infecções, a aplicação de métodos de análise em single-cell será necessária para caracterizar completamente essa interação complexa entre patógeno e hospedeiro. Essa abordagem sistemática pode revelar como a comunidade viral pode estar cooperando ou interferindo na expressão do gene da célula hospedeira. Nosso objetivo é realizar o sequenciamento de LMNCs baseado em RNA e DNA de célula única dos principais imunotipos (linfócitos T CD4+ e CD8+, linfócitos B, macrófagos e células dendríticas), obtidas a partir de amígdalas palatinas hipertróficas e adenoides de crianças com hipertrofia tonsilar e de tecidos post-mortem de adultos. A análise de sequência permitirá a segregação de células infectadas por SARS-CoV-2 e influenza daquelas não infectadas de mesmo imuno-fenótipo e, portanto, permitirá comparações entre elas em relação a vários aspectos, como expressão de genes antivirais e inflamatórios, RNAs não codificadores de diferentes classes e os seus perfis epigenéticos. Além disso, as LMNCs infectadas serão cultivadas e avaliadas quanto à viabilidade, capacidade de se dividir em resposta a mitógenos. MLNCs não infectadas naturalmente serão infectadas ex vivo com estoques de vírus para verificar a sua permissividade à infecção. LMNCs primárias humanas e linhas celulares contínuas também serão usadas para infecção in vitro para validar genes candidatos e caminhos selecionados nas análises de célula única. Para o presente estudo, serão utilizadas amígdalas de crianças submetidas a amigdalectomia para tratamento de complicações obstrutivas relacionadas à hipertrofia tonsilar, e tecidos de adultos obtidos post-mortem. As LMNCs serão purificadas de tecidos linfoides recém-dissociados por seleção negativa baseada em esferas magnéticas para minimizar a ativação celular durante o processamento. Além da dissociação do tecido para análise de célula única, os fragmentos de tecido serão preservados no RNAlater® para extração de ácido nucleico e testes de detecção de vírus por PCR em tempo real. Alíquotas de backup de tecidos dissociados também serão mantidas para testes adicionais posteriores ou ensaios de validação. (AU)