Avaliação do perfil imunológico, da espermatogênese e esteroidogênese em camundongos K18-hACE2 infectados por SARS-CoV-2

Resumo

As proteínas ACE2 e TMPRSS2 permitem a entrada do Vírus SARS-CoV-2 na célula hospedeira, provocando a COVID-19, uma síndrome respiratória aguda grave. Além das células pulmonares, essas proteínas estão presentes em níveis consideráveis nas células dos testículos. Alguns estudos têm demonstrado a presença do vírus no sêmen, bem como baixos níveis de testosterona e alterações testiculares em pacientes com COVID-19. O testículo é um órgão com características únicas e complexas que mantem a esteroidogênese e a espermatogênese constantes, garantindo a fertilidade masculina. Portanto, o aumento de citocinas causado por infecções virais pode afetar comprometer a espermatogênese, a esteroidogênese e a integridade dos espermatozoides. A criação recente do novo camundongo transgênico K18-hACE2 tem contribuído para o estudo da COVID-19, pois esses animais expressam a ACE2 humana (hACE2). A proteína spike do vírus liga-se à hACE2 nas células desses animais, infectando-as e causando a doença. Neste estudo, será proposto verificar quais células testiculares expressam hACE2 e se estas células são infectadas pelo Vírus SARS-CoV-2 nos testículos de camundongos K18-hACE2. Será também avaliada a integridade estrutural e funcional deste órgão frente a resposta inflamatória da COVID-19, a presença de infiltrado inflamatório e os níveis de citocinas pró-inflamatórias, correlacionando-as à expressão de fatores envolvidos na via de sinalização JAK-STAT. Uma ênfase será dada ao impacto da infecção na expressão de fatores de transcrição que regulam a esteroidogênese (SF-1 e Nur-77), bem como de seus genes-alvo (StAR E 3B-HSD). A fim de melhor compreender as alterações estruturais do epitélio seminífero, fatores do eixo HPG também serão avaliados. Serão utilizados 20 camundongos K18-hACE2 adultos, distribuídos em 2 grupos (n=6): grupo controle (GC) e grupo 5 dias (G5D). Os animais do G5D serão inoculados com o vírus por via intranasal. Os animais do GC serão inoculados com meio de cultura DMEM. Após 5 dias, os órgãos serão coletados, fixados e processados para inclusão em parafina para as análises morfológicas e morfométricas. Fragmentos testiculares serão incluídos em Araldite para análise ultraestrutural ao Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET). Amostras também serão congeladas (-80°C) para análise molecular (Western blot-WB e qPCR). Nos cortes histológicos, a detecção de ACE2, TMPRSS2 e proteína viral spike será realizada por imunofluorescência, bem como o vírus será detectado por MET. Reações imuno-histoquímica e/ou de imunofluorescência serão realizadas para a detecção de: citocinas pró-inflamatórias (IL-1±, IL-1², IL-2, IL-6, INF-³, TNF-±), NF-kB, iNOS, linfócitos T (CD8, CD4), macrófagos (CD68, CD163), Ki-67 (mitose/meiose), Kisspeptina (Kiss1); ABP (Androgen Binding Protein), transferrina (marcador funcional de CS), conexina-43 (barreira hemato-testicular), proteínas esteroidogênicas (StAR, 3²-HSD) e incidência de morte celular pelo método do TUNEL. A expressão gênica da via JAK-STAT, em associação à expressão de NF-kB, será avaliada por meio de RT-qPCR, assim também como a expressão dos fatores de transcrição esteroidogênicos, Nurr77 e SF-1, bem como seus downstream genes - StAR e 3²-HSD. A expressão gênica dos fatores envolvidos no eixo HPG (Kiss1, Kiss1R, Lhcgr e Fshr) também serão avaliados. Nos extratos testiculares, ACE2, TMPRSS2 e os níveis de iNOS, NF-kB e ABP serão avaliados por WB, e os níveis de testosterona, IL-1², IL-6 e TNF-± serão avaliados por ELISA. As áreas tubular e epitelial serão mensuradas, e o número de células de Sertoli, de espermatócitos, bem como de túbulos alterados será quantificado. As diferenças entre os grupos serão avaliadas pelo Student-T Test (pd0,05). (AU)