Consumo de oxigênio mitocondrial no sistema nervoso central e musculatura de drosófilas mutantes para Twinkle

Resumo

Mais de 30 mutações já foram descritas no gene humano TWNK, que codifica a helicase replicativa mitocondrial Twinkle. Essas mutações tem consequências clinicas heterogêneas, mas em geral afetam o sistema neurolocomotor. A oftalmoplegia externa progressiva autossômica dominante (adPEO), frequentemente causada por mutações em TWNK, é uma doença neuromuscular de início tardio em que os pacientes podem apresentar fraqueza progressiva dos músculos oculares externos e/ou da musculatura esquelética, neuropatia axonal sensorial, ataxia, Parkinsonismo e depressão. adPEO é caracterizado principalmente pelo acumulo em grande escala de várias deleções no DNA mitocondrial (mtDNA) de fibras musculares durante a vida dos pacientes, mas também já foram observadas deleções em diferentes regiões do sistema nervoso central. Embora a adPEO seja uma doença relativamente rara, ela representa um modelo importante, visto que as deleções de mtDNA aumentam em frequência em neurônios e fibras musculares de indivíduos humanos normais a medida que estes envelhecem. Manter o genoma mitocondrial intacto e no nível apropriado requer uma série de proteínas envolvidas na replicação, transcrição, reparo e recombinação. Embora Twinkle possa participar do reparo recombinacional, seus papeis no processo de replicação do mtDNA são mais bem compreendidos. Quando o mtDNA está sendo copiado, Twinkle transloca-se à frente da forquilha de replicação, hidrolisando NTPs e promovendo o abertura da dupla fita de mtDNA parental. Dados ainda não publicados do nosso laboratório indicam que Twinkle tem funções tecido-especifico em Drosophila, que tem sido muito utilizada como organismo modelo para o entendimento dos processos relacionados à replicação do mtDNA. O intuito deste projeto é mensurar o consumo de oxigênio mitocondrial em cabeças e tóraxes de linhagens de drosófilas com mutações na Twinkle, seguindo um protocolo já bem estabelecido em nosso laboratório. A medição do consumo de oxigênio associado à oxidação de substratos mitocondriais será feita em tempo real através do sistema de respirometria de alta resolução Oxygraph-2k (O2k, Oroboros Instruments). Avaliaremos a fosforilação oxidativa, a capacidade máxima de transferência de elétrons e a respiração leak. O nível de acoplamento entre o consumo de oxigênio e a fosforização do ADP será estimado através da taxa de controle respiratório, para qual o valor de respiração no estado de OXPHOS, será dividido pelo valor de leak.(AU)