Estudo da mutagênese mitocondrial induzida por peróxido de hidrogênio e metil-metanosulfonato em fibroblastos de camundongos

Resumo

A mitocôndria é uma organela presente na maioria dos eucariotos que atua em processos de geração de energia, sendo fundamental para a homeostase celular. O DNA mitocondrial (mtDNA) codifica 37 genes, incluindo 2 RNAs ribossômicos, RNAs transportadores e 13 polipeptídeos, componentes de 4 dos cinco complexos proteicos da fosforilação oxidativa. Mutações somáticas neste genoma acumulam-se em câncer e envelhecimento normal em mamíferos, o que mostra a importância de manter a sua integridade. Em estudos com diferentes organismos, constatou-se que o mtDNA apresenta taxas de mutações maiores que o DNA nuclear, mas as causas e o padrão mutagênico deste fenômeno não foram completamente elucidadas. A teoria mitocondrial do envelhecimento propõe que a proximidade entre o mtDNA e a cadeia transportadora de elétrons deixa o genoma mitocondrial mais exposto a espécies oxidantes, e este acumularia mutações com o passar do tempo, resultando em organelas disfuncionais. Neste modelo, oxidantes gerados durante o transporte de elétrons são considerados os principais agentes mutagênicos endógenos do mtDNA. Entretanto, vários resultados recentes não encontraram o padrão mutagênico previsto para lesões oxidativas e não corroboram essa teoria. Por outro lado, estudos com camundongos transgênicos expressando DNA polimerase gama (Pol ³) com atividade exonuclease deficiente (denominados mutator mice), demonstraram que os erros replicativos podem gerar acúmulo expressivo de mutações de ponto e deleções no mtDNA, resultando em um fenótipo de envelhecimento precoce e diminuição da expectativa de vida. A importância de Pol ³ nas mutações originadas no processo replicativo foi demonstrada, porém seu papel na mutagênese induzida por lesões ainda não foi investigado. Além disso, recentemente foi demonstrada a presença de DNA polimerase beta (Pol ²) na mitocôndria, sendo provável que atue no reparo por excisão de bases no mtDNA. Por isso propomos investigar a mutagênese no mtDNA induzida por lesões e a participação de Pol ³ e Pol ² nesse processo. O estudo será feito com fibroblastos primários de camundongos C57/B16 do tipo selvagem; selvagem com expressão de Pol ² diminuída e Pol ³ exonuclease deficientes (derivadas de mutator mice). As células serão expostas a doses sub-letais de duas genotoxinas: peróxido de hidrogênio e metil-metanosulfonato, que geram bases oxidadas e alquiladas, respectivamente. Para cada tratamento serão medidas: i) a formação de lesões e as taxas de reparo, utilizando Long-range qPCR ; ii) taxa de mutação, utilizando Random Mutation Capture Assay ; iii) os tipos de mutação, utilizando sequenciamento automático método Sanger.