Avaliação de técnicas para inserção de ácidos nucleicos em plasmócitos

Resumo

A inserção de ácidos nucleicos tais como plasmídeos de DNA ou fragmentos de RNA, visando à edição genômica, em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) aos quais se incluem os plamócitos, é uma tarefa difícil, principalmente devido à baixa eficiência. Vários métodos estão disponíveis comercialmente, portanto o objetivo deste trabalho será testar os diferentes métodos de inserção de ácidos nucleicos em plamócitos, para encontrar o mais eficiente e com menor toxicidade. Plamócitos totais isolados com microbeads magnéticas a partir do PBMC de três doadores saudáveis serão cultivados e submetidos à transfecção por partículas lipídicas contendo um plasmídeo circular de DNA. O mesmo plasmídeo de DNA também será inserido utilizando eletroporação. Num terceiro grupo, o gene desejado será inserido nos plamócitos utilizando partículas virais carregadoras, mais precisamente lentivírus. O plasmídeo ou lentivírus deverá conter pelo menos um gene capaz de produzir uma proteína fluorescente na cor verde, como GFP. A observação dos plasmócitos transfectados ou transduzidos no microscópio de fluorescência permitirá estimar proporcionalmente a eficiência do método de inserção de material genético. A toxicidade do procedimento será avaliada pela incorporação de Iodeto de Propídeo, marcador na cor vermelha que indica a desestabilização da membrana plasmática, ou seja, células em processo de morte. Esperamos neste trabalho identificar o melhor método para inserção nos plamócitos dos genes da Cas9 e dos RNAs guia para execução de técnicas de edição genômica nestas células.(AU)