Edição múltipla do genoma baseada em complexos ribonucleoproteicos CRISPR/Cas9 para a geração de células T-CAR alogênicas prontas para o uso

Resumo

O uso de células T autólogas expressando receptores de antígeno quiméricos (CAR) revolucionou a terapia contra neoplasias de células B. Entretanto, o uso de células T-CAR alogênicas está associado a inúmeras vantagens sobre esta abordagem autóloga, como a disponibilidade imediata de lotes criopreservados para infusão, padronização do produto celular final, tempo para múltiplas modificações genéticas nas células e possibilidade de novas infusões. Essa estratégia também permite o escalonamento da produção das células T-CAR com concomitante redução de custos, o que atualmente representa um desafio para países de média e baixa renda. Portanto, uma das próximas fronteiras do campo é desenvolver uma terapia alogênica pronta para o uso. Isto pode ser conseguido através da depleção do receptor de células T (TCR) das células T-CAR usando ferramentas de edição gênica para evitar o desenvolvimento da doença do enxerto versus hospedeiro. Além disso, a depleção do antígeno leucocitário humano I (HLA-I) nas células T-CAR reduziria as chances de rejeição destas células pelo sistema imunológico do paciente. Durante o desenvolvimento do projeto FAPESP 2020/02043-2, estabelecemos com sucesso uma plataforma baseada na transdução lentiviral e eletroporação de plasmídeos para a expressão do CAR e depleção do TCR ou HLA-I através do sistema CRISPR/Cas9. Esta plataforma nos permitiu identificar as sequências de gRNA com maior eficiência de edição. Entretanto, este sistema baseado em plasmídeos dificulta a edição simultânea do TCR e HLA-I. Além disso, a eletroporação de plasmídeos é consideravelmente tóxica para as células T, e a expressão de Cas9 usando este sistema é mais longa e associada a um número mais elevado de mutações fora do alvo quando comparada aos complexos de ribonucleoproteínas (RNPs). Neste projeto, nosso objetivo é aprimorar a nossa metodologia de CRISPR/Cas9 através do estabelecimento de um protocolo de edição gênica múltipla baseada em RNPs para a produção de células T-CAR alogênicas deficientes na expressão do TCR e HLA-I. O uso de RNPs têm se tornado uma abordagem de destaque para aplicação clínica, visto que os complexos são imediatamente ativos, menos tóxicos para as células T, exibem menos efeitos fora do alvo e permitem a edição simultânea de múltiplos genes. Para facilitar o processo de implementação desta nova abordagem, estabelecemos uma colaboração estratégica com o Prof. Krishanu Saha que tem ampla experiência com biologia sintética e edição gênica em diferentes tipos celulares, incluindo as células T. Estamos confiantes que esta oportunidade de financiamento contribuirá para a nucleação de uma rede internacional para o desenvolvimento de terapias celulares alogênicas avançadas, mais seguras e potencialmente acessíveis a um maior número de pacientes em comparação com a abordagem autóloga atual. Além disso, a plataforma de edição gênica estabelecida nessa colaboração poderá ser facilmente aplicada na modulação de vias celulares visando o aumento da eficiência terapêutica das células T-CAR, bem como na correção de deficiências genéticas subjacentes a doenças incuráveis atualmente.