RESISTA-Test©: refinamento de metodologia para a detecção da resistência anti-helmíntica e validação em rebanhos ovinos

Resumo

O aumento da ocorrência de resistência anti-helmíntica dos nematoides gastrintestinais em ovinos tem gerado a necessidade de desenvolver novos testes para detecção da resistência ou aprimorar os já existentes. O Teste de Desenvolvimento Larvar (TDL) pode desacelerar o estabelecimento da resistência e preservar a eficácia dos anti-helmínticos. Um teste de diagnóstico recém desenvolvido baseado no TDL, chamado RESISTA-Test© (Processo FAPESP 2016/07132-8), utiliza placas de 96 poços e possibilitou uma economia real de 52% dos custos do diagnóstico da resistência, em comparação ao TDL convencional. O RESISTA-Test© foi desenvolvido para avaliar a eficácia de quatro grupos químicos de anti-helmínticos utilizados no Brasil (benzimidazois, imidotiazois, avermectinas e derivados amino-acetonitrila). Ele apresentou ótimos resultados, comparáveis ao teste de redução na contagem de ovos nas fezes (TRCOF), tendo boa concordância entre eles. Propõe-se neste projeto um refinamento do RESISTA-Test©: 1) incluir mais um grupo químico no RESISTA-Test© por meio do desenvolvimento de um protocolo e da validação do uso do closantel; 2) melhorar a acurácia na detecção da resistência para o levamisol e o monepantel por meio da realização do RESISTA-Test© e do TRCOF em 15 rebanhos ovinos; 3) validar o RESISTA-Test© para outros gêneros de nematoides gastrintestinais; 4) elaborar um manual para a coleta, acondicionamento e envio de fezes ovinas para a execução do RESISTA-Test©. Para a validação do closantel quatro cordeiros serão utilizados como doadores de fezes para produção de larvas infectantes (L3), dois animais serão infectados artificialmente com um isolado de Haemonchus contortus susceptível a todos os anti-helmínticos e dois outros animais com um isolado resistente. As diluições dos anti-helmínticos serão realizadas conforme descrito previamente no RESISTA-Test©, enquanto que as diluições a serem produzidas para o closantel serão padronizadas para os isolados brasileiros. Para o TDL as fezes dos animais serão lavadas para recuperação dos ovos com o uso sequencial de peneiras e o teste será realizado seguindo a metodologia com as adaptações e validações realizadas para o RESISTA-test©. O TRCOF será realizado em 15 rebanhos de ovinos, que deverão ter no mínimo 42 animais (pelo menos sete animais/tratamento: albendazol, levamisol, ivermectina, monepantel, closantel e controle negativo). Para a melhoraria da acurácia do RESISTA-Test© para levamisol e monepantel, bem como para a validação para o closantel e para outros gêneros parasitários, será feito estudo comparativo dos resultados do RESISTA-Test© (que detecta a resistência in vitro) e do TRCOF (que detecta a resistência in vivo). Também será desenvolvido um manual para o RESISTA-Test©, descrevendo desde o processo de coleta das fezes dos ovinos, envio até o laboratório e retorno do laudo para os produtores com os resultados do anti-helmíntico mais eficaz na propriedade. Além disso, 30 larvas L3 de H. contortus de cada propriedade serão destinadas à extração de DNA e à genotipagem por teste molecular para detecção da resistência anti-helmíntica. Para isso, serão avaliados os seguintes polimorfismos: I) SNP F200Y no isotipo 1 do gene da beta-tubulina, associado à resistência aos benzimidazois; II) InDel de 63 bp no gene acr-8, associado à resistência ao levamisol; e III) InDel de 6 bp 852_857del no éxon 11 do gene mptl-1, associado à resistência ao monepantel, após otimização da metodologia de eletroforese para InDels pequenas. Assim, espera-se fornecer ferramentas a serem utilizadas na rotina laboratorial para monitoramento da resistência anti-helmíntica, reduzir custos provenientes da situação atual de multirresistência, racionalizar o uso dos anti-helmínticos e retardar o aparecimento da resistência, minimizando os custos das atividades de produção, tornando-as mais interessantes aos produtores. (AU)