Caracterização bioquímica e imunológica de proteínas hipotéticas de superfície de Leptospira interrogans

Resumo

A leptospirose humana é uma doença tropical negligenciada emergente causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira, com mais de 1 milhão de casos relatados em todo o mundo. Não existem vacinas eficazes para a leptospirose humana. China, Cuba, França e Japão possuem uma vacina de células inteiras inativadas (bacterina) para uso em trabalhadores de grupos de risco, mas não apresenta proteção em longo prazo e seu uso é limitado. A vacina bacterina não confere proteção cruzada contra sorovares que não estão incluídos na preparação. Alguns mecanismos patogênicos são conhecidos como a ligação e degradação das células da membrana extracelular do hospedeiro mediadas pelas proteínas da membrana externa de Leptospira. A Leptospira pode se espalhar no sangue do hospedeiro sendo capaz de sobreviver ao sistema imunológico, adquirindo plasminogênio solúvel e convertendo-o em plasmina para degradar diversas proteínas presentes no plasma e coágulos de fibrina. Além disso, a ligação a componentes ou reguladores da via do sistema complemento permite que a Leptospira sobreviva ao sistema imunológico. Duas proteínas identificadas na membrana externa de L. interrogans, LIC10774 e LIC13086 podem se ligar a diferentes componentes do hospedeiro, como laminina, plasminogênio, fibrinogênio, trombina, fibronectina plasmática, C4BP e componentes da via do complemento, exibindo um papel multifuncional durante o processo de infecção. Assim, nosso objetivo é produzir mutantes desses genes em Leptospira spp. patogênicas por troca alélica para investigar o efeito funcional e patogênico dessa deleção no genoma. Para realizar a mutagênese, um plasmídeo suicida será construído contendo a região flanqueadora a região upstream e downstream dos fragmentos de genes que codificam as LIC10774 e LIC13086, contendo uma região de resistência à espectinomicina substituindo os genes. O plasmídeo será transformado em E. coli para ser utilizado na transferência por conjugação para estirpes patogênicas de Leptospira. Após isso, com a troca alélica bem sucedida, os mutantes de LIC10774 e LIC13086 serão avaliados em relação à capacidade de ligação a componentes do hospedeiro, semelhante a proteína recombinante. Além disso, os mutantes serão testados para determinar se eles mantêm sua virulência, utilizando hamsters como modelo, em comparação com a infecção do tipo selvagem. Se os animais infectados com mutantes sobrevivem, uma análise mais abrangente pode ser realizada para determinar o LD50, bem como um desafio vacinal usando os mutantes como vacina viva para imunizar hamsters. Adicionalmente, as proteínas recombinantes LIC10774 e LIC13086 podem ser boas candidatas para uma vacina de subunidade, devido ao seu papel multifuncional na patogênese. Desse modo, um desafio será realizado com três doses das proteínas recombinantes como vacina de subunidade utilizando hamster como modelo. Como resultado, pretendemos aumentar o conhecimento na aplicação da técnica de nocaute genético, entender melhor os mecanismos de patogenicidade e possivelmente desenvolver uma vacina eficaz. (AU)