Estudo do potencial terapêutico de novos moduladores do canal de cálcio lisossomal hTRPML1

Resumo

O genoma humano codifica três proteínas TRPML (do inglês, "Transient Receptor Potential Mucolipin"). Esta proteínas evolutivamente relacionadas são canais de cátions seis transmembranas, permeáveis ao Ca2+ e não seletivas que pertencem a grande família de canais de íons do Potencial Receptor Transiente (TRP). Acredita-se que o TRPML1 esteja envolvido na homeostase endo/lisossomal e seu mau funcionamento esta relacionado a doenças de armazenamento de lipídios, como a Mucolipidose IV (MLIV). Até agora, carece-se de pequenas moléculas potentes que possam ser utilizadas para investigar as funções celulares e o potencial terapêutico de modulação da atividade do canal TRPML1. A razão para isso esta na dificuldade de se obter proteínas de membrana recombinantes e nas limitações experimentais que avaliam a ligação do composto na localização celular certa. Na celula humana, os TRPMLs estão embutidos na membrana dos endossomos e lisossomos e, portanto, os compostos precisam atravessar a membrana celular plasmatica para chegar a essas organelas. Um grande desafio no desenvolvimento de moduladores TRPML1 é a falta de ensaios baseados em células para investigar a ligação na célula de compostos ao canal TRPML1 em sua localização fisiológica, apropriadamente embutidos em endo/lisossomos. Aqui nos propomos a abordar o desafio de compreender a biologia do TRPML1 nos termos de sua drogabilidade. Inicialmente, iremos desenvolver moléculas sintéticas, do inglês, "tracers" específicas para criar um novo ensaio de engajamento de alvos celulares para TRPML1, usando a transferência de energia por ressonância de bioluminescência (BRET). Esta técnica depende da proximidade de um doador (TRPML1 fundido a uma luciferase) e um aceitador (uma versão fluorescente de um agonista TRPML1). O ensaio BRET será então usado para identificar moduladores de TRPML1 relatados na literatura que são permeáveis as células. Este ensaio também servirá para otimizar compostos iniciais para ligação TRPML1, mantendo a permeabilidade celular. Iremos adquirir e sintetizar moléculas candidatas para avaliar em BRET e acompanhar com experimentos biológicos de ativação/inativação do TRPML1 usando ensaios de mobilização de Ca2+ e abordar efeitos fora do alvo sugeridos por ferramentas de predição de polifarmacologia. Os moduladores TRPML1 otimizados gerados neste projeto devem permitir elucidar a relevância farmacológica do canal TRPML1 em condições relacionadas a doenças, como distúrbios lisossomais. (AU)