Mapeamento e caracterização mecanística da interação da proteína humana HspA5 (BiP/Grp78/erHsp70) com a co-chaperona humana Hep1 e com a proteína Spike do Coronavírus SARS-CoV-2

Resumo

As proteínas de choque térmico de 70 kDa (Hsp70) são chaperonas moleculares que atuam no controle da qualidade proteica celular. Elas são proteínas monoméricas, ubíquas, altamente conservadas e são compostas por um Domínio de Ligação a Nucleotídeos (DLN) e um Domínio de Ligação a Peptídeos/substratos (DLP). Para direcionar seu ciclo funcional, as Hsp70 contam com o auxílio de nucleotídeos adenosina e de proteínas auxiliares: as co-chaperonas. A HspA5 (Grp78/BiP/erHsp70) é a isoforma da Hsp70 humana que reside principalmente no Retículo Endoplasmático (RE) e desempenha diversos papeis celulares essenciais, como enovelamento e reenovelamento de proteínas, regulação desinalização celular, resposta a proteínas desenoveladas, regulação da homeostase de cálcio, etc. Devido a esses papeis, a HspA5 tem sido amplamente estudada como alvo terapêutico em diferentes tipos de doenças, incluindo a COVID-19. É sabido que em condições de estresse, a HspA5 pode se deslocar para amembrana plasmática e atuar como receptor celular, interagindo com proteínas virais, como a proteína Spike do novo Coronavírus. Diferentes estudos também têm demonstrado que a HspA5 está presente nas mitocôndrias, no entanto sua rede de interações na mitocôndria é pouco estabelecida. Dados do grupo de Bioquímica e Biofísica de Proteínas (IQSC/USP) demostraram, de forma inédita, a interação estável entre o DLN da HspA5 e a proteína Hsp70-escort protein 1 humana (hHep1). Apesar da hHep1 ter sido reportada como uma co-chaperona exclusiva da Hsp70 mitocondrial humana (HspA9, mortalina), dados dogrupo de pesquisa demostram que a hHep1 está também presente no nucleoplasma, e que esta modula a atividade ATPásica da HspA1A (principal Hsp70 humana induzível). Portanto, a hHep1 pode modular outras Hsp70 presentes no nucleoplasma e mitocôndria. Neste contexto, esse projeto propõe: i) mapear a interação in vitro da HspA5 com o domínio de ligação ao receptor (RBD) da proteína Spike do SARSCov2 e ii) caracterizar o mecanismo de interação entre a HspA5 e a hHep1, bem como obter o interatoma destas proteínas. Para isso, as proteínas recombinantes HspA5 humana e a RBD_Spike serão expressas e purificadas, a fim de se estudar a formação do complexo proteico por meio de técnicas biofísicas. Neste contexto, as proteínas recombinantes HspA1A e HspA8 serão utilizadas para fins comparativos. Adicionalmente, expressar e purificar os somínios heterólogos DLN e DLP da HspA5 humana e a hHep1, a fim de realizar a caracterização mecanística comparativa da interação da hHep1 com a HspA5 e seus domínios. Os efeitos da hHep1 sobre a atividade ATPásica da HspA5 também serão avaliados, além de ensaios comparativos da ação da hHep1 sobre a prevenção de proteólise e de agregação/oligomerização doDLN das proteínas HspA1A e HspA5. Ademais, serão realizados ensaios celulares a fim de avaliar a colocalização entre a HspA5 e hHep1, e mapear a potencial interação entre elas e suas parceiras celulares, por meio do método BioID combinado a espectrometria de massas. Posteriormente, também objetiva-se caracterizar a interação entre o DLN_HspA5 com a hHep1 por meio de cristalografia de proteínas. Dados do grupo de pesquisa indicam que avaliação da interação da hHep1 com a HspA1A ou HspA9 tem limitações técnicas (interações pouco estáveis ou quantidades delimitadas das Hsp70). Portanto, a interação estável com a HspA5 pode permitir uma análise comparativa das diferentes Hsp70 humanas e permitir avanços consideráveis no entendimento dos mecanismos moleculares da hHep1 sobre as Hsp70 humanas. Dessa forma, será realizado um estudo aprofundado da HspA5 com o intuito de elucidar processos de interações proteicas diferenciais e, consequentemente, obter uma análise integrada dos processos celulares aos quais a hHep1 está envolvida. Portanto, o conhecimento resultante desse projeto poderá servir como base para o desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento de doenças humanas, incluindo a COVID-19. (AU)