Caracterização molecular de sequências promotoras de transcrição em Plasmodium

Resumo

Parasitas do gênero Plasmodium possuem ciclo de vida complexo, com estágios de desenvolvimento em hospedeiros mamíferos e artrópodes. Os estágios se diferenciam pela expressão de genes específicos, controlados por mecanismos transcricionais e pós-transcricionais. Análise genética de Plasmodium identificou poucos elementos no DNA envolvidos no controle da transcrição e poucos fatores de transcrição específicos conservados (TFs), sugerindo a presença de TFs específicos não relacionados a domínios de ligação de DNA previamente descritos. Promotores de Plasmodium foram avaliados funcionalmente por transfecção de P. falciparum. No entanto, P. falciparum é distante evolutivamente das outras espécies que infectam humanos. P. vivax e os outros parasitas da Malária humana (P. knowlesi, P. malariae e P. ovale) são agrupados no clado da Malária de primatas, separados de P. falciparum, membro do clado Laverania. A distância evolutiva está correlacionada a diferenças biológicas entre as espécies, como preferência da célula hospedeira, mecanismos de invasão celular e desenvolvimento de gametócitos. Tentativas de caracterizar promotores de P. vivax utilizando transfecção de P. falciparum falharam, sugerindo diferenças no controle de transcrição. Recentemente, P. knowlesi foi adaptado para cultura, proporcionando um novo modelo de pesquisa. O cultivo in vitro de P. knowlesi e P. falciparum permite o planejamento de experimentos lado a lado, capazes de comparar diferenças e identificar características conservadas nas espécies. Resultados preliminares mostraram que sequências regulatórias de P. vivax podem ser avaliadas por transfecção de P. knowlesi. Analisamos sequências promotoras de P. vivax - pvhsp70, pvcrt e pvcam - por transfecção de P. knowlesi e P. falciparum com plasmídeos contendo o gene repórter luciferase (luc). Todas as sequências promotoras testadas foram capazes de induzir expressão de luc em P. knowlesi. Como esperado, sequências promotoras pvcam e pvcrt não são reconhecidas por P. falciparum, mas o promotor pvhsp70 foi capaz de induzir expressão de luc em ambas as espécies. Resultados sugerem que o promotor pvhsp70 contém elementos conservados em três espécies: P. vivax, P. falciparum e P. knowlesi. Para identificar elementos funcionais no promotor pvhsp70, vamos desenvolver uma série de plasmídeos com diferentes tamanhos do promotor, induzindo a expressão de luc. Os plasmídeos serão usados para transfectar P. knowlesi e P. falciparum. Plasmídeos sem os elementos necessários para o início da transcrição produzirão menor atividade luc. Para restringir as sequências específicas responsáveis pelo controle transcricional, realizaremos ensaios de deslocamento em gel - técnica que explora o fato de que o DNA ligado por proteína migra mais lentamente em um gel do que o DNA livre. Usaremos extratos de P. falciparum e P. knowlesi para se ligar a fragmentos de DNA, permitindo a identificação de qualquer elemento que interaja com proteínas nucleares. Para confirmar se as sequências têm um papel no controle da transcrição, desenharemos novos plasmídeos, deletando esses elementos ou adicionando esses elementos aos promotores de P. vivax não reconhecidos por P. falciparum (pvcam, pvcrt). Além disso, queremos identificar os elementos que participam do controle de expressão específico do estágio. Para tanto, usaremos parasitas sincronizados em estágio e buscaremos mudanças de expressão nos diferentes estágios do parasita. Finalmente, a análise in silico determinará se existem várias regiões promotoras de genes em um único genoma que compartilham o elemento funcional identificado, e se existem genes específicos, como hsp70, que possuem elementos conservados em todas as espécies. Os resultados combinados fornecerão uma visão sobre a evolução do controle transcricional entre os parasitas da Malária. (AU)