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Mecanismos de resistência de Glioblastoma ao antitumoral temozolomida em células cultivadas como esferoides multicelulares tumorais em três dimensões (3D) in vitro: o papel das polimerases de síntese translesão

Processo: 20/02836-2
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 01 de setembro de 2021
Vigência (Término): 31 de agosto de 2023
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Mutagênese
Pesquisador responsável:Carlos Frederico Martins Menck
Beneficiário:Diego Luis Ribeiro
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:19/19435-3 - Papel de danos no DNA e função mitocondrial em envelhecimento vascular, imune e neurológico (DNA MoVINg), AP.TEM
Assunto(s):Reparo do DNA   Glioblastoma   Glioma   Temozolomida   Esferoides celulares   DNA polimerase dirigida por DNA   Sequenciamento completo do exoma   Quimiorresistência

Resumo

O Glioblastoma Multiforme (GBM) é o tipo de tumor mais agressivo e indiferenciado que acomete o Sistema Nervoso Central (SNC). Na quimioterapia, o antitumoral Temozolomida (TMZ) demonstra os melhores benefícios clínicos por penetrar facilmente na barreira hematoencefálica. TMZ promove lesões no DNA ao adicionar radicais metil (-CH3) em bases nitrogenadas, que podem ocasionar substituições de nucleotídeos, quebras de fitas ou bloqueios na maquinaria de replicação, desencadeando a morte celular. Todavia, o aparecimento de células resistentes a TMZ é um dos maiores problemas no tratamento de GBM. Entre os fatores relacionados, os mecanismos de reparo de DNA, incluindo Síntese Translesão (TLS), aparecem como candidatos importantes por permitirem as células cancerosas remover e/ou tolerar as lesões na molécula do DNA. Mais especificamente, DNA polimerases TLS (TLS pols) permitem as células tolerar danos genômicos por meio de bypass de lesões, evitando assim o estresse replicativo e garantindo a sobrevivência celular. Além disso, esse processo pode desenvolver instabilidade genômica, aumentando o repertório das células tumorais para desenvolvimento de resistência. Neste projeto pretendemos focar os estudos nas TLS pols da família Y [Pol Eta (Pol ·), Kappa (Pol º), Iota (Pol ¹) e Rev1] como potenciais enzimas de resistência à TMZ em GBM, através de estudos em células depletadas dessas enzimas por ferramentas de edição genômica. De fato, resultados iniciais previamente obtidos pelo nosso grupo identificaram TLS pols (Pol ¹ e Pol º) associadas à resistência a TMZ em linhagem celular de glioma in vitro. Neste projeto, pretendemos estender esses estudos com células cultivadas em modelos tridimensionais (3D) in vitro. Nessas condições as células compartilham propriedades do microambiente tumoral correspondente ao in vivo, e podem auxiliar a melhor entender os mecanismos que essas TLS polimerases atuam na resistência a esse quimioterápico. Especificamente, nos propomos a cultivar células tumorais de GBM (U-251) nocautes para as TLS pols da família Y (Pol ¹ e Pol º) em Esferoides Multicelulares Tumorais (EMTs) em 3D e, paralelamente, gerar outras linhagens celulares de GBM (U-251) nocautes (Pol · e Rev1) por CRISPR-Cas9, para assim analisar os efeitos dos tratamentos com o antitumoral TMZ. Nestas avaliações pretende-se investigar as respostas das células deficientes frente ao tratamento com TMZ por meio de análises de volume/integridade e de migração/invasão celular dos EMTs; aplicação de ensaios de citotoxicidade; estudos de cinética de ciclo, capacidade de ultrapassar a fase S, e dos tipos de morte celular; execução de ensaios de genotoxicidade, e mensuração da elongação na forquilha de replicação do DNA. Adicionalmente, avaliações em modelos in vivo com tumores xenográficos induzidos de linhagens de GBM serão executados para análises comparativas de resposta a TMZ. Por fim, objetivamos também a realização de sequenciamento de exoma completo (Whole-Exome Sequencing; WES) para identificar as mutações induzidas pelo quimioterápico, comparando os dados de células deficientes e complementadas para TLS pols tanto para modelos 3D (in vitro) quanto para animais (in vivo). Com os resultados, espera-se compreender melhor o papel de TLS pols da família Y na resistência a danos provocados por TMZ, indicando caminhos potenciais para a terapia de pacientes com GBM. (AU)

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