Impacto de distintos scFv em GXMR-CAR expresso por linfócitos T na etapa de ativação celular frente a Cryptococcus spp

Resumo

A criptococose é uma infecção fúngica oportunista causada através da inalação de propágulos ou esporos do agente etiológico Cryptococcus gattii ou Cryptococcus neoformans. A espécie C. gattii acomete principalmente indivíduos imunocompetentes, enquanto C. neoformans, indivíduos imunocomprometidos, sendo responsável pela meningite fúngica em alto número de adultos portadores do vírus HIV. Os patógenos C. neoformans e C. gattii apresentam como principal fator de virulência a cápsula polissacarídica associada a parede fúngica. A cápsula contém majoritariamente glucuronoxilomanana (GXM) e proporções menores de glucuroxilomanogalactana (GXMGal) e manoproteínas que representam menos de 1% do peso capsular. O polissacarídeo GXM é capaz de inibir a ativação de linfócitos T e reduzir a sobrevida de macrófagos. Na criptococose, altas concentrações séricas de GXM são encontradas e a imunoterapia com anticorpos monoclonais específicos para GXM se mostrou eficaz na redução de níveis séricos de GXM e na maior sobrevida de animais acometidos por C. neoformans. Dentre esses anticorpos monoclonais anti-GXM, os clones 2H1 e 18B7 estão devidamente caracterizados no contexto do complexo antígeno-anticorpo. Tendo em vista o conhecimento detalhado acerca da região de interação do clone 18B7, essa informação foi adotada na construção de um receptor antigênico quimérico (CAR) para redirecionar células T citotóxicas contra Cryptococcus spp, esse receptor é denominado GXMR-CAR. A utilização dessa terapia celular na criptococose foi inicialmente desenvolvida pelo responsável da atual proposta, e a continuidade dessa abordagem é contemplada pelo Auxílio Jovem Pesquisador (2018/18538-0). A bioengenharia de linfócitos T através da tecnologia do CAR permite que as células T reconheçam alvos na superfície de células fúngicas e, com isso, sejam ativadas de maneira independente da fusão MHC-TCR. Com isso, a atual proposta comparará o efeito de GXMR-CAR contendo diferentes scFv, porção de reconhecimento para GXM, oriundos dos clones 2H1 e 18B7, durante a ativação de células T modificadas e o reflexo citotóxico frente as leveduras de Cryptococcus spp. A avaliação de diferentes scFv na estrutura do CAR tem importância no nível de ativação e sobrevida das células T modificadas, isso refletirá no efeito citotóxico sobre o alvo desejado. Dessa forma, a proposta atual procederá com os seguintes objetivos específicos: (i) produção de partículas lentivirais contendo a sequência codificadora das formas 2H1-GXMR-CAR e 18B7-GXMR-CAR; (ii) geração de células de linhagem Jurkat estáveis para esses receptores; (iii) avaliar a interação dessas células Jurkat com leveduras de C. gattii e C. neoformans e o efeito na ativação celular; (iv) transdução de PBMC com os construtos das formas 2H1-GXMR-CAR ou 18B7-GXMR-CAR para quantificar a produção de mediadores pró-inflamatórios, grânulos citotóxicos e a proliferação celular após a incubação com as leveduras; (v) avaliar in vitro a capacidade de células T modificados com 2H1-GXMR-CAR ou 18B7-GXMR-CAR em reduzir o crescimento leveduriforme e alterar a susceptibilidade de Cryptococcus spp frente a fármacos antifúngicos. (AU)