Identificação de assinaturas de CEC oral via proteômica quantitativa multiplexed e análise de modificações pós-traducionais em vesículas extracelulares de alta pureza isoladas de saliva e plasma

Resumo

Vesículas extracelulares (VEs) desempenham um papel chave na progressão do câncer e metástase mediando mudanças no microambiente tumoral, matriz extracelular e nichos pré-metastáticos de forma a favorecer o crescimento e dispersão dos tumores. A metástase linfonodal é o principal fator prognóstico em pacientes com carcinoma oral de células escamosas (CEC), podendo reduzir as taxas de sobrevida para menos que 50% nos 5 anos após diagnóstico. Atualmente não há marcadores moleculares para metástase linfonodal em CEC oral. Neste contexto, o projeto FAPESP de pós doutorado 2018/11958-4 propôs a aplicação de métodos de proteômica e peptidômica na caracterização molecular de VEs no intuito de identificar potenciais marcadores da progressão de CEC oral e ocorrência de metástase linfonodal. Durante o primeiro ano deste projeto nós desenvolvemos uma metodologia de análise combinada por proteômica e peptidômica a partir da saliva de pacientes com (N+) e sem mestástase (N0) linfonodal (manuscrito em preparação). Por meio da abordagem peptidômica potenciais assinaturas moleculares com utilidade prognostica foram identificadas e, juntamente à análise proteômica, possíveis mecanismos relacionados à proteólise foram associados à progressão do CEC oral. No entanto, a aplicação de tais análises em preparações de VEs é um desafio devido ao baixo rendimento proteico, mesmo em condições otimizadas para máxima recuperação de VEs a partir de plasma e saliva. Por isso, a caracterização dessas preparações requer o refinamento do desenho experimental e instrumentação com maior sensibilidade para alcançar melhor eficiência e confiabilidade na identificação e quantificação de proteínas e peptídeos. Este projeto BEPE propõe o uso de marcação isobárica por TMT (tandem mass tag) para análise multiplexed por LC-MS em condições de alta sensibilidade para estudo de VEs isoladas a partir de plasma e saliva de pacientes (controle, n=20; N0, n=20; N+, n=20). Esta abordagem permitirá a aquisição de dados quantitativos de alta qualidade e avaliação de moléculas diferenciais associadas à progressão do CEC oral, bem como a análise de modificações pós-traducionais (PTM; e.g. fosforilação e ubiquitinação) nas proteínas carreadas por EVs. A realização de análises com alta sensibilidade, juntamente às informações adicionais de peptidômica e PTMs, nos proporcionará uma posição única na descoberta de potenciais assinaturas moleculares para verificação na fase 2 do projeto principal (2018/2019-4) a ser continuado no Brasil, utilizando uma nova coorte de pacientes. (AU)