Desenvolvimento de transfecção de P. knowlesi in vitro e P. cynomolgi in vivo utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9

Resumo

Técnicas de edição genômica estão facilitando o desenvolvimento de organismos transgênicos, aumentando a eficiência e reduzindo o tempo necessário para a geração destas linhagens. Estre estas técnicas está CRISPR/Cas9, que se baseia no reparo de quebras na dupla fita de DNA induzidas em pontos específicos do genoma. Após a quebra, as células rapidamente reparam o DNA, utilizando vias de recombinação homóloga (HR) ou não homóloga. Durante o reparo por HR a maquinaria de reparo utiliza uma sequência com extremidades homólogas à sequência alvo, que podem conter mutações ou inserções de novos genes. Recentemente, o grupo do Dr. Robert Moon, do Reino Unido, adaptou a tecnologia CRISPR/Cas9 para P. knowlesi permitindo a rápida geração de parasitas transgênicos para estudos das mais variadas características. Neste projeto pretendemos estabelecer esta tecnologia em nosso laboratório, gerando linhagens de P. knowlesi transgênicos e também adaptar a tecnologia para P. cynomolgi - espécie que nunca teve seu DNA alterado por técnicas de edição genômica. Entramos em contato com o grupo do Dr. Moon, que já nos forneceu os plasmídeos e protocolos para estabelecer a técnica, além de oferecer todo o apoio. Vamos gerar uma linhagem transgênica repórter contendo o gene da proteína bioluminescente NanoLuc, inserido no genoma de P. knowlesi. Para isso pretendemos inserir um "cassete" contendo o promotor do gene pkhsp70 controlando a expressão de NanoLuc no locus do gene p230p, previamente alterado pelo grupo do Dr. Moon - o que não acarretou em alterações funcionais. Os parasitas transgênicos bioluminescentes serão utilizados em ensaios de ação de drogas, e em ensaios de transmissão para mosquitos anófeles, o que será feiro em parceria com o grupo do Dr. Thomas Wellems (NIH, Bethesda-EUA). O gene p230p também será o alvo para edição genômica de P. cynomolgi, obtido em infecções experimentais de macacos rhesus e cynomolgous, que ocorrerão no ICTB (Instituto de Ciência e Tecnologia de Biomodelos - FIOCRUZ), em colaboração com o grupo do Dr. Leonardo Carvalho (FIOCRUZ - RJ).Também vamos gerar linhagens repórteres de gametócitos, para o isolamento destas formas evolutivas. Para isso, vamos inserir no locus p230p um "cassete" contendo o promotor de um gene específico de gametócitos (pks16) controlando a expressão da proteína flurescente mCherry. Desta forma, apenas os gametócitos se tornarão vermelhos, permitindo seu isolamento por citometria de fluxo. Estes parasitas nos permitirão estudar detalhes destas formas evolutivas, que ocorrem em baixo número em P. knowlesi e são essenciais para a transmissão para mosquitos. (AU)