Filogenômica de Cladochytriales (Chytridiomycota): uma nova abordagem para os fungos zoospóricos

Resumo

A classificação morfológica tradicional dos representantes de Chytridiomycota vêm passando por profundas reestruturações devido a disponibilização de dados de sequências gênicas e a investigação das diferenças na ultraestrutura dos zoósporos. Atualmente o filo conta com nove ordens, com Rhizophydiales, Chytridiales e Cladochytriales representando as mais expressivas em número de espécies. As duas primeiras foram intensamente estudadas nos últimos anos com relação à filogenia de genes ribossomais, sistemática e dados de ultraestrutura dos zoósporos, para as quais foram propostas novas famílias, gêneros e espécies. Cladochytriales, por outro lado, tem sido pouco estudada filogeneticamente e esparsas modificações foram realizadas desde a sua proposição. Recentemente, uma nova abordagem tem sido empregada para o estudo das relações filogenéticas no reino Fungi, a qual tem se baseado em dados genômicos. Este possui inúmeras vantagens se comparado as abordagens génicas, as quais são restritas a pequenos fragmentos do DNA ribossomal e mitocondrial, já que avalia a relação evolutiva baseado no genoma completo dos organismos. Diferentemente dos representantes de Ascomycota, Basidiomycota e Zygomycota sensu Moreau, para os quais dados genômicos tem transformado nossa compreensão das relações filogenéticas e processos evolutivos, esta abordagem ainda não foi realizada para os de Chytridiomycota de uma forma mais ampla. Considerando o exposto, propõe-se neste projeto de pesquisa sequenciar o genoma completo de representantes de Cladochytriales depositados no "MICH Herbarium", objetivando responder as hipóteses da proposta original bem como a origem da catenulação e polifilia de alguns gêneros. Para isso, 21 táxons depositados no "MICH Herbarium" foram selecionados para sequenciamento do genoma por representarem as espécies tipos dos gêneros incluídos na ordem, apresentarem ampla distribuição geográfica e/ou posicionamento filogenético indefinido. Culturas das espécies alvo serão reativadas e inoculadas em meios de cultura sólido PmTG e CMAg para os procedimentos de extração do DNA genômico. Após esse procedimento, reações de amplificação de deslocamento múltiplo (MDA) serão preparadas com "MDA master mix" e as bem-sucedidas serão diluídas para controle de qualidade e pureza por análise de PCR. Após a confirmação da espécie alvo, cada reação MDA será preparada como uma biblioteca separada através do kit "Nextera XT Library Prep". As bibliotecas independentes serão sequenciadas no Joint Genome Institute (JGI) e o controle de qualidade preliminar das leituras brutas será realizado com o fastqc 0.11.5. As bibliotecas para cada espécie individual serão montadas em SPAdes 3.10.0 e os "contigs" com menos de 1000 pares de base serão removidos. Como os conjuntos provavelmente serão metagenomas, usaremos três critérios de abordagem para a categorização das sequências, com o intuito de separar o genoma alvo de possíveis contaminações. Dentre esses estão o ESOM 1.1, gráficos de "blob" com cobertura de GC e combinação de uso de RSCU (códon sinônimo relativo) e ClaMS. O genoma final incluirá apenas os "contigs" identificados como parte do genoma alvo por pelo menos duas dessas abordagens. As árvores de genes serão inferidas no RAxML 8.2.8, usando modelos de substituição determinados automaticamente, com 500 replicas bootstrap. Por fim, uma árvore consenso será construída com ASTRAL 5.6.1, utilizando as árvores individuais de genes. Essa proposta representa uma abordagem inédita de sequenciamento do genoma de representantes desta ordem, ampliando a informação sobre dados genômicos para os fungos, em especial para as linhagens basais. (AU)